Zellpenetrierende Peptide ( CPPs ) sind kurze Peptide , die die Aufnahme von Molekülen in Zellen erleichtern, von Nanopartikeln über kleine chemische Verbindungen bis hin zu großen DNA- Fragmenten . Die „Fracht“ ist entweder über kovalente Bindungen oder über nicht-kovalente Wechselwirkungen an die Peptide gebunden . [ 1 ]

Zellpenetrierende Peptide (CPPs) transportieren Substanzen in Zellen, üblicherweise durch Endozytose , für Forschung und Medizin. Derzeit ist ihre Anwendung durch mangelnde Zellspezifität beim CPP-vermittelten Transport von Substanzen und unzureichendes Verständnis der Aufnahmemechanismen eingeschränkt. Weitere entwickelte Transportmechanismen sind CellSqueeze und Elektroporation .

CPPs weisen typischerweise eine Aminosäurezusammensetzung auf , die entweder einen hohen relativen Anteil positiv geladener Aminosäuren wie Lysin oder Arginin enthält oder Sequenzen mit einem alternierenden Muster polarer , geladener und unpolarer , hydrophober Aminosäuren aufweist . [ 2 ] Diese beiden Strukturtypen werden als polykationisch bzw. amphipathisch bezeichnet . Eine dritte Klasse von CPPs bilden die hydrophoben Peptide, die ausschließlich apolare Reste mit geringer Nettoladung oder hydrophobe Aminosäuregruppen enthalten, welche für die zelluläre Aufnahme entscheidend sind. [ 3 ] [ 4 ]

Der transaktivierende Transkriptionsaktivator (TAT) des humanen Immundefizienzvirus 1 (HIV-1) war das erste entdeckte CPP. 1988 stellten zwei Labore unabhängig voneinander fest, dass TAT ​​von zahlreichen Zelltypen in Kultur effizient aus dem umgebenden Medium aufgenommen werden kann . [ 5 ] Seitdem hat sich die Anzahl bekannter CPPs erheblich erhöht, und es wurden synthetische Analoga mit kleinen Molekülen und effektiveren Proteintransduktionseigenschaften entwickelt . [ 6 ]

Eine kürzlich gemachte Entdeckung ergab, dass Papillomaviren , wie beispielsweise das humane Papillomavirus , CPPs nutzen, um die intrazelluläre Membran zu durchdringen und so den retrograden Transport der viralen Einheit zum Zellkern auszulösen. [ 7 ]

Mechanismen der Membrantranslokation

Zellpenetrierende Peptide (CPPs) unterscheiden sich in Größe, Aminosäuresequenz und Ladung, können aber alle die Plasmamembran durchdringen und den Transport verschiedener Moleküle ins Zytoplasma oder zu einem Organell ermöglichen . [ 1 ] Der Translokationsmechanismus ist noch nicht vollständig geklärt, jedoch lassen sich die Kandidaten in drei Kategorien einteilen: direkte Membranpenetration, endozytosevermittelter Eintritt und Translokation durch eine temporäre Struktur. Die CPP-Transduktion ist Gegenstand aktueller Forschung. [ 8 ] [ 9 ]

Zellpenetrierende Peptide (CPP) können verschiedene Arten von Frachtmolekülen durch die Plasmamembran transportieren und fungieren somit als molekulare Transportvehikel. Sie finden vielfältige Anwendung in der Medizin, beispielsweise als Wirkstoffträger zur Behandlung verschiedener Krankheiten, darunter Krebs und Viren, sowie als Kontrastmittel zur Zellmarkierung. Beispiele für letztere sind ihre Funktion als Träger für GFP , MRT-Kontrastmittel oder Quantenpunkte . [ 10 ]

Direkte Penetration

Beispiel für die Umlagerung von Fracht durch direkte Durchdringung

Frühere Studien gingen überwiegend davon aus, dass die Translokation polykationischer CPPs durch biologische Membranen über einen energieunabhängigen zellulären Prozess erfolgt. Man nahm an, dass die Translokation bei 4 °C ablaufen kann und höchstwahrscheinlich eine direkte elektrostatische Wechselwirkung mit negativ geladenen Phospholipiden beinhaltet . Forscher schlugen verschiedene Modelle vor, um den biophysikalischen Mechanismus dieses energieunabhängigen Prozesses aufzuklären. Obwohl CPPs direkte Auswirkungen auf die biophysikalischen Eigenschaften reiner Membransysteme haben, führte die Identifizierung von Fixierungsartefakten bei Verwendung fluoreszenzmarkierter CPP-Sonden zu einer Neubewertung der CPP-Importmechanismen. [ 11 ] Diese Studien favorisierten die Endozytose als Translokationsweg. Für TAT wurde ein Beispiel für die direkte Penetration vorgeschlagen. Der erste Schritt dieses Modells ist eine Wechselwirkung zwischen dem ungefalteten Fusionsprotein (TAT) und der Membran durch elektrostatische Wechselwirkungen. Diese Wechselwirkungen stören die Membran so weit, dass das Fusionsprotein sie passieren kann. Nach der Internalisierung faltet sich das Fusionsprotein mithilfe des Chaperonsystems wieder zusammen. Dieser Mechanismus war nicht allgemein anerkannt, und es wurden andere Mechanismen vorgeschlagen, die Clathrin-abhängige Endozytose beinhalten. [ 12 ] [ 13 ]

Es wurden zahlreiche detailliertere Methoden zur Aufnahme zellpenetrierender Peptide (CPP) vorgeschlagen, darunter die Bildung transienter Poren. [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] Dieser Mechanismus beinhaltet starke Wechselwirkungen zwischen zellpenetrierenden Peptiden und den Phosphatgruppen beiderseits der Lipiddoppelschicht , die Insertion positiv geladener Arginin-Seitenketten, welche die Bildung einer transienten Pore initiieren, und die anschließende Translokation der zellpenetrierenden Peptide durch Diffusion auf der Porenoberfläche. Dieser Mechanismus erklärt, wie Schlüsselfaktoren wie die Kooperation der Peptide, die hohe positive Ladung und insbesondere die Guanidiniumgruppen zur Aufnahme beitragen. Der vorgeschlagene Mechanismus verdeutlicht zudem die Bedeutung von Membranfluktuationen. Tatsächlich könnten Mechanismen, die große Fluktuationen der Membranstruktur beinhalten, wie transiente Poren und die Insertion geladener Aminosäure-Seitenketten, weit verbreitet und möglicherweise zentral für die Funktionen vieler Membranproteine ​​sein .

Endozytose-vermittelte Translokation

Arten der Endozytose durch zellpenetrierende Peptide

Endozytose ist ein weiterer Mechanismus der zellulären Internalisierung. Bei der Endozytose stülpt sich die Plasmamembran nach innen, um Substanzen in die Zelle zu befördern. Zellen absorbieren dabei Material von außerhalb der Zelle, indem sie es mit ihrer Zellmembran aufnehmen . Die Klassifizierung der zellulären Lokalisation mittels Fluoreszenz oder Endozytose-Inhibitoren bildet die Grundlage der meisten Untersuchungen. Allerdings liefert das bei der Probenpräparation angewandte Verfahren fragwürdige Informationen zur Endozytose. Studien zeigen zudem, dass die zelluläre Aufnahme von Penetratin durch Endozytose ein energieabhängiger Prozess ist. Dieser Prozess wird durch die Interaktion von Polyargininen mit Heparansulfaten initiiert , welche die Endozytose fördern. Untersuchungen haben gezeigt, dass TAT ​​durch eine Form der Endozytose, die sogenannte Makropinozytose, internalisiert wird. [ 19 ] [ 20 ]

Studien haben gezeigt, dass Endozytose an der Internalisierung von CPPs beteiligt ist, es wurde jedoch vermutet, dass verschiedene Mechanismen gleichzeitig ablaufen können. Dies wird durch das für Penetratin und Transportan beschriebene Verhalten belegt, bei dem sowohl Membrantranslokation als auch Endozytose gleichzeitig erfolgen. [ 21 ] [ 22 ]

Translokation durch die Bildung einer Übergangsstruktur

Translokation vermittelt durch die Bildung invertierter Mizellen

Der dritte Mechanismus der Translokation beruht auf der Bildung inverser Mizellen . Inverse Mizellen sind Aggregate kolloidaler Tenside, in denen die polaren Gruppen im Inneren konzentriert sind und die lipophilen Gruppen nach außen in das Lösungsmittel ragen. Gemäß diesem Modell verbindet sich ein Penetratindimer mit den negativ geladenen Phospholipiden und bildet so eine inverse Mizelle innerhalb der Lipiddoppelschicht. Die Struktur der inversen Mizellen ermöglicht es dem Peptid, in einer hydrophilen Umgebung zu verbleiben. [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] Dieser Mechanismus ist jedoch weiterhin Gegenstand der Diskussion, da die Verteilung des Penetratins zwischen innerer und äußerer Membran nicht symmetrisch ist. Diese asymmetrische Verteilung erzeugt ein gut erforschtes elektrisches Feld. Eine Erhöhung der Peptidmenge auf den äußeren Membranblättern führt dazu, dass das elektrische Feld einen kritischen Wert erreicht, der ein elektroporationsähnliches Ereignis auslösen kann.

Der letzte Mechanismus impliziert, dass die Internalisierung durch Peptide der Familie der primären amphipathischen Peptide, MPG und Pep-1, erfolgt. Basierend auf physikochemischen Studien, darunter Circulardichroismus- , Fourier-Transform-Infrarot- und Kernspinresonanzspektroskopie , wurden zwei ähnliche Modelle vorgeschlagen. Diese Modelle sind mit elektrophysiologischen Messungen und Untersuchungen verknüpft, die Modellmembranen wie Monoschichten an der Luft-Wasser-Grenzfläche simulieren können. Die Struktur, die die Poren bildet, ist der Hauptunterschied zwischen dem vorgeschlagenen MPG- und dem Pep-1-Modell. Im MPG-Modell wird die Pore durch eine β-Fassstruktur gebildet, während sie bei Pep-1 mit Helices assoziiert ist. Darüber hinaus wurden in beiden Modellen starke hydrophobe Phospholipid-Peptid-Wechselwirkungen entdeckt. [ 26 ] [ 27 ] In den beiden Peptidmodellen korrelieren die gefalteten Bereiche des Trägermoleküls mit der hydrophoben Domäne, während der Rest des Moleküls unstrukturiert bleibt. [ 28 ]

Translokation vermittelt durch eine Übergangsstruktur

Die durch zellpenetrierende Peptide (CPP) vermittelte Translokation ist Gegenstand intensiver Diskussionen. Es gibt Hinweise darauf, dass die Translokation über verschiedene Aufnahmewege erfolgen kann. Zudem kann der Translokationsmechanismus davon abhängen, ob das Peptid frei vorliegt oder an Fracht gebunden ist. Die quantitative Aufnahme von freiem oder an Fracht gebundenem CPP kann stark variieren, jedoch konnte bisher nicht geklärt werden, ob diese Unterschiede auf die Translokationseffizienz oder auf den jeweiligen Translokationsweg zurückzuführen sind. Wahrscheinlich deuten die Ergebnisse darauf hin, dass mehrere CPP-Mechanismen miteinander konkurrieren und verschiedene Wege zur Internalisierung von CPP beitragen. [ 29 ]

Anwendungen

Nukleinsäure-Lieferung

Nukleinsäurebasierte Makromoleküle wie siRNA, Antisense-Oligonukleotide, Decoy-DNA und Plasmide sind vielversprechende biologische und pharmakologische Therapeutika zur Regulation der Genexpression . [ 30 ] [ 31 ] [ 32 ] Im Gegensatz zu anderen niedermolekularen Wirkstoffen sind ihre Entwicklung und Anwendung jedoch durch ihr hohes Molekulargewicht und ihre negativen Ladungen eingeschränkt, was zu einer geringen Aufnahmeeffizienz und einem niedrigen zellulären Transport führt. Um diese Probleme zu überwinden, wurden verschiedene Verabreichungssysteme entwickelt, darunter CPP-Nukleinsäure-Konjugate, die sich als besonders wirksames Werkzeug erwiesen haben.

Bildung von CPP-Nukleinsäure-Komplexen

Kovalente Bindung zwischen CPP und Nukleinsäure
Kovalente Bindung zwischen CPP und Nukleinsäure

Die meisten bisher vorgeschlagenen CPP-Nukleinsäure-Komplexe basieren auf kovalenten Bindungen. Verschiedene CPP-Nukleinsäure-Komplexe wurden mittels unterschiedlicher chemischer Verfahren synthetisiert, die entweder stabile oder spaltbare Bindungen ermöglichen. Die am häufigsten publizierte Methode sind spaltbare Disulfidbindungen, die durch schrittweise Festphasensynthese oder Fragmentkopplung in Lösung oder an der Festphase hergestellt werden. [ 33 ] Weitere Strategien, wie stabile Amid-, Thiazolidin-, Oxim- und Hydrazinbindungen , wurden ebenfalls entwickelt. [ 34 ] Diese kovalenten Bindungsmethoden sind jedoch durch die Befürchtung eingeschränkt, dass die synthetische kovalente Bindung zwischen CPP und Nukleinsäure die biologische Aktivität der Nukleinsäure verändern könnte. [ 35 ] Daher wurde eine neue, nicht-kovalente Strategie, die keine chemische Modifizierung erfordert und kurze amphipathische CPPs wie MPG und Pep-1 als Träger nutzt, erfolgreich für den Transport von Wirkstoffen eingesetzt. [ 36 ] [ 37 ] Diese nicht-kovalenten Konjugate entstehen entweder durch elektrostatische oder hydrophobe Wechselwirkungen. Mit dieser Methode lassen sich Frachten wie Nukleinsäuren und Proteine ​​effizient transportieren, wobei ihre volle biologische Aktivität erhalten bleibt.

siRNA-Übertragung

Kurze interferierende RNA (siRNA) ist ein leistungsstarkes neues Werkzeug, das die Expression spezifischer Krankheitsgene beeinflussen und unterdrücken kann. [ 38 ] Um die zelluläre Aufnahme von siRNA zu verbessern, wurden CPP-Strategien (Cell-Protocol-Partikel) eingesetzt, um die siRNA-Einschleusung in Zellen über kovalente oder nicht-kovalente Bindungen zu erleichtern. In einer Studie wurde siRNA kovalent über eine Disulfidbrücke am 5'-Ende der Sense-Stränge an Luciferase- oder eGFP-mRNA-Reportergene gebunden, um deren Transport und Penetration zu ermöglichen. [ 39 ] In einer anderen Studie wurde ein TAT-siRNA-Konjugat über eine stabile Thiomaleimid-Bindung am 3'-Ende der siRNA in HeLa-Zellen eingebracht, um das eGFP-Gen zu unterdrücken. [ 40 ]

Nicht-kovalente Strategien scheinen jedoch für die siRNA-Übertragung besser geeignet zu sein und eine stärkere biologische Reaktion hervorzurufen. In einer Studie wurde gezeigt, dass MPG/siRNA-Komplexe, die mittels einer stabilen nicht-kovalenten Strategie gebildet wurden, erfolgreich in kultivierte Zellen eingebracht werden konnten und eine robuste Regulation der Ziel-mRNA induzierten. [ 37 ] Darüber hinaus wurden MPG/siRNA-Komplexe auch für die In-vivo -Übertragung von siRNA in Mausblastozyten zur Genregulation eingesetzt. [ 41 ] MPG bildet stabile Komplexe mit siRNA, die eine geringe Abbaurate aufweisen und sich leicht für spezifisches Targeting funktionalisieren lassen. Dies sind wesentliche Vorteile gegenüber der kovalenten CPP-Technologie.

Neues Substratdesign für die siRNA-Übertragung

Die zelluläre Verabreichung von siRNA stellt ein wertvolles Instrument zur Behandlung von Krebs, Virusinfektionen und genetischen Erkrankungen dar. Klassische Strategien basieren jedoch auf der kovalenten Verknüpfung von Frachtmolekülen und CPPs, was keinen effizienten Schutz der siRNA-Moleküle in vivo gewährleistet ; die in der Literatur berichteten Ergebnisse sind daher uneinheitlich. Kürzlich wurden nicht-kovalente Strategien erfolgreich beschrieben. Sekundäre amphipathische Peptide, basierend auf aromatischen Tryptophan- und Argininresten, die über Lysin als Spacer verknüpft sind, wurden unter dem Namen CADY beschrieben. CADY enthält eine kurze Peptidsequenz von 20 Aminosäuren mit der Sequenz „Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-Cysteamid“ [ 42 ] . Dieses Peptid kann sich selbst zu einer Helixstruktur zusammenlagern, wobei sich hydrophile und hydrophobe Reste auf gegenüberliegenden Seiten des Moleküls befinden. Es weist zwei unterschiedliche Oberflächenorientierungen auf, die jeweils die niedrigste Energie darstellen, und kann Komplexe mit siRNA in verschiedenen molaren Verhältnissen von 1:1 bis 80:1 bilden. CADY ist in der Lage, eine Schutzschicht um das siRNA-Molekül zu bilden und es so vor biologischen Abbauprozessen zu schützen, die vor dem Eindringen in die Zelle auftreten können. Derartige Substrate könnten wichtige Anwendungen in vivo ermöglichen .

Antisense-Oligomer-Verabreichung

Antisense-Oligonukleotide (asONs) werden in der Grundlagenforschung eingesetzt und als mögliche medizinische Therapien weiterentwickelt. Es wurden CPP-Strategien entwickelt, um Antisense-Oligomere wie PNA und PMO in Zellen einzuschleusen. Durch die Überwindung der Abstoßung negativ geladener Oligonukleotide durch die Zellmembran und den enzymatischen Abbau von asONs erhöhen CPPs die Bioverfügbarkeit von asONs. Zwei Arten neutraler ON-Analoga, Peptidnukleinsäure ( PNA ) und Phosphorodiamidat-Morpholino-Oligomere (PMO oder Morpholino ), gewinnen in diesem Bereich zunehmend an Bedeutung. PNA wurde über Disulfidbrücken oder stabile Amidbindungen mit verschiedenen CPPs konjugiert. [ 43 ] Beispielsweise wurde eine Antisense-Aktivität in Zellen beobachtet, die die Expression des Galanin-Rezeptors blockierte, wenn ein 21-mer PNA an Penetratin gekoppelt war. [ 44 ] Es wurden auch Ergebnisse zur antiviralen Aktivität von PNA gegen HIV-1 durch Disulfidbindung mit TAT berichtet. [ 45 ] CPP-PMO-Konjugate wurden auch erfolgreich zur Hemmung der Replikation verschiedener Viren wie SARS [ 46 ] und Influenza [ 47 ] eingesetzt , und die Anbindung von CPPs verbesserte die Wirksamkeit von spleißmodifizierenden Morpholinos in der Entwicklung zur Behandlung der Duchenne-Muskeldystrophie [ 48 ].

Köder-DNA-Übertragung

Decoy-DNA ist eine exogene doppelsträngige DNA (dsDNA), die eine Promotorsequenz imitieren und dadurch die Aktivität eines spezifischen Transkriptionsfaktors hemmen kann. [ 49 ] Allerdings weist dsDNA, wie andere Therapeutika auch, eine geringe Bioverfügbarkeit auf. In einer Studie wurden die CPPs TP und TP10 an NFκB-Decoy-DNA gekoppelt, wodurch die Interleukin-1-induzierte NFκB-Aktivierung und die IL-6-Genexpression blockiert wurden. [ 50 ] In einer anderen Studie verringerte TP10-gekoppelte Myc-Decoy-DNA die Proliferationsfähigkeit von N2a-Zellen. [ 51 ]

Plasmid-Übertragung

Einzelne Gene können an spezifischen Stellen auf Plasmiden eingefügt und rekombinante Plasmide in lebende Zellen eingebracht werden. Eine Methode mit makroverzweigtem TAT wurde für die Plasmid-DNA-Übertragung in verschiedene Zelllinien vorgeschlagen und zeigte signifikante Transfektionsraten. [ 52 ] Multimere von TAT erhöhten die Transfektionseffizienz von Plasmid-DNA um das 6- bis 8-Fache im Vergleich zu Poly-L-Arginin oder der Mutante TAT2-M1 und um das 390-Fache im Vergleich zu Standardvektoren. [ 53 ]

Proteinzufuhr

Die Entwicklung therapeutischer Proteine, die eine wertvolle Methode zur Behandlung von Krankheiten darstellt, wird durch die geringe Effizienz traditioneller Verabreichungsmethoden eingeschränkt. Die Bewertung der cytosolischen Freisetzung von CPP-gebundenen Proteinen ist anfällig für Artefakte [ 54 ] und erfordert daher den Einsatz von Bewertungsmethoden, die eine tatsächliche cytosolische Freisetzung von zelloberflächengebundenen oder endosomal eingeschlossenen CPP-Proteinen unterscheiden können [ 55 , 56 ] . In jüngster Zeit wurden mehrere Methoden beschrieben, die CPPs als Vehikel für die Verabreichung biologisch aktiver, vollständiger Proteine ​​in lebende Zellen und Tiere nutzen.

Mehrere Gruppen haben erfolgreich CPP-Fusionsproteine ​​in vitro transfiziert . TAT konnte verschiedene Proteine, wie z. B. Meerrettichperoxidase und RNase A, in unterschiedlichen Zelllinien in vitro durch die Zellmembran ins Zytoplasma transportieren . Die Proteine ​​konnten effektiv in den Größenbereich von 30 kDa bis 120–150 kDa transfiziert werden. In einer Studie wurden TAT-Fusionsproteine ​​mittels Lipid-Raft-abhängiger Makropinozytose schnell internalisiert. Dies wurde mithilfe eines transduzierbaren TAT-Cre-Rekombinase-Reporterassays an lebenden Zellen nachgewiesen. [ 57 ] In einer anderen Studie wurde ein TAT-Fusionsprotein in die Mitochondrien von Brustkrebszellen eingebracht und reduzierte deren Überlebensrate. Dies zeigt, dass TAT-Fusionsproteine ​​die Mitochondrienfunktion und das Zellüberleben modulieren können. Darüber hinaus ermöglichte cR10, ein zyklisches Polyarginin-CPP, die endozytoseunabhängige Transduktion von Antigen-bindenden Proteinen durch die Zellmembran mit sofortiger Bioverfügbarkeit. Dadurch konnten die Autoren der Studie fluoreszierende Antigen-bindende Proteine ​​in Zellen einbringen und so die Immunfärbung lebender Zellen ermöglichen. [ 58 ] Allerdings waren bisher nur wenige In-vivo-Studien erfolgreich. In einer Studie führte die In-vivo-Verabreichung von TAT- oder Penetratin-vernetzten Fab-Fragmenten zu unterschiedlichen Organverteilungen und einer insgesamt erhöhten Organretention, was auf eine Gewebelokalisierung hindeutet. [ 59 ]

Um die Einschränkungen kovalenter Methoden, wie die chemische Modifizierung vor der Vernetzung und die Denaturierung von Proteinen vor der Verabreichung, zu überwinden, wurde eine nicht-kovalente Methode zur Bildung von CPP/Protein-Komplexen entwickelt. In einer Studie erwiesen sich ein kurzer amphipathischer Peptidträger, Pep-1, und Proteinkomplexe als effektiv für die Verabreichung. Es konnte gezeigt werden, dass Pep-1 die schnelle zelluläre Aufnahme verschiedener Peptide, Proteine ​​und sogar vollständiger Antikörper mit hoher Effizienz und geringer Toxizität ermöglicht. Dieser Ansatz hat die Formulierung von Reagenzien erheblich vereinfacht. [ 60 ]

Kontrastmitteltransport

Ein verbessertes Substrat für CPP, das die Proteolyseeffekte minimiert
Faltungskontrolle von CPP mithilfe unnatürlicher β,δ-cyclischer Aminosäuren

CPPs finden Anwendung als Transporter von Kontrastmitteln durch Plasmamembranen. Diese Kontrastmittel können Tumorzellen markieren und sind daher wichtige Werkzeuge in der Krebsdiagnostik; sie werden auch in zellulären In-vivo- und In-vitro -Experimenten eingesetzt. Die wichtigsten CPP-Klassen werden aus Viren isoliert, wie beispielsweise TAT (Transaktivierte Transkription) aus HIV-1, Penetratin und Transportan. Die am häufigsten verwendeten CPPs basieren auf TAT-Derivaten. TAT ist ein argininreiches CPP. Zu den Verbesserungen dieses Substrats gehört die Verwendung nicht-natürlicher β- oder γ-Aminosäuren. Diese Strategie bietet mehrere Vorteile, wie beispielsweise Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau, einem natürlichen Abbauprozess, bei dem Peptidbindungen zu Aminosäuren hydrolysiert werden. Der Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren in die Peptidkette hat ebenfalls mehrere Vorteile. Er erleichtert die Bildung stabiler Foldamere mit ausgeprägter Sekundärstruktur. [ 61 ] [ 62 ] [ 63 ] β-Peptide sind in wässriger Lösung konformationell stabiler als natürlich vorkommende Peptide, insbesondere bei kurzen Ketten. Die Sekundärstruktur wird durch eine starre β-Aminosäure verstärkt, die Cyclohexan- oder Cyclopentanfragmente enthält. Diese Fragmente führen zu einer höheren Steifigkeit der Struktur und beeinflussen den Öffnungswinkel des Foldamers. Diese Eigenschaften sind wichtig für das Design neuer Peptide. Helikale β-Peptide ahmen die antimikrobiellen Aktivitäten von Wirtsabwehrpeptiden nach. [ 64 ] [ 65 ] [ 66 ] Diese Eigenschaft erfordert die Orientierung kationischer – hydrophiler – Reste auf der einen und hydrophober Reste auf der anderen Seite der Helix. Die Anbindung einer Fluoreszenzgruppe an einem Ende des Moleküls verleiht Kontrasteigenschaften. Eine neue Strategie zur Verbesserung der zellulären Aufnahmekapazität von CPP basiert auf der Assoziation polykationischer und polyanionischer Domänen, die durch einen Linker getrennt sind. Die zelluläre Assoziation von polykationischen Resten (Polyarginin) mit negativ geladenen Zellmembranen wird durch das Vorhandensein eines polyanionischen Restes (Polyglutaminsäure) und des Linkers effektiv blockiert. Diese gewährleisten den optimalen Abstand zwischen den beiden geladenen Resten, um deren Wechselwirkung zu maximieren. Die Peptide bilden eine Haarnadelstruktur aus, was durch die Korrelation des Overhauser-Effekts für die Proton-Proton-Abstände der beiden geladenen Einheiten bestätigt wird. In diesem Stadium ist in vivo nur der Linker der Proteasehydrolyse ausgesetzt.Anwendungen. Die Linkerhydrolyse führt zu einer erhöhten Konformationsfreiheit der beiden geladenen Fragmente. Fehlt der Linker, kann das kationische Peptid effizienter mit der Zielzelle interagieren, und die zelluläre Aufnahme erfolgt vor der Proteolyse. Diese Strategie fand Anwendung bei der Markierung von Tumorzellen in vivo . Die Tumorzellen wurden innerhalb von Minuten markiert. Der Linkerabbau lässt sich anhand der Menge an D-Aminosäuren (dem unnatürlichen Isomer), die in die Peptidkette eingebaut sind, vorhersagen. Dies beschränkt die Proteolyse in vivo auf den zentralen Linker. [ 67 ] [ 68 ] [ 69 ] [ 70 ]

Kontrastmittel als Frachtmoleküle

Quantenpunkte
Anwendungen von Quantenpunkten zur Zellmarkierung

Quantenpunkte (QDs) stellen eine relativ neue Klasse fluoreszierender Sonden dar, die im Vergleich zu klassischen organischen Farbstoffen auf Basis fluoreszierender Gruppen überlegene optische Eigenschaften aufweisen. Zu den Hauptvorteilen von QDs zählen hohe Quantenausbeuten, breite Absorptionsspektren, größenabhängige Emissionsspektren und eine gute Beständigkeit gegenüber chemischem und photochemischem Abbau. In-vivo-Tests haben gezeigt, dass verschiedene positiv geladene Peptide (basierend auf Guanidinresten) Zellmembranen durchdringen und die zelluläre Aufnahme von daran gebundenen Molekülen, einschließlich Quantenpunkten, fördern können. Die Eigenschaften von QDs lassen sich durch die Variation der daran gebundenen organischen Substrate leicht modifizieren, wodurch sie sich als vielseitiges biologisches Werkzeug zur Zellmarkierung eignen. Derzeit wird an der Optimierung der Methoden für die intrazelluläre Verabreichung von QDs und QD-Biokonjugaten sowie an der Charakterisierung ihrer langfristigen photophysikalischen Eigenschaften in vivo geforscht. [ 71 ] [ 72 ] [ 73 ] [ 74 ] [ 75 ]

Quantenpunkte sind kolloidale Nanokristalle, die auf einem Cadmium-Selen (CdSe)-Kern basieren, der von einer Zink-Schwefel (ZnS)-Schicht umhüllt ist. Dieses Substrat wird intensiv als Zellmarker eingesetzt, da CdSe im sichtbaren Bereich emittiert und ein hervorragendes Kontrastmittel darstellt. Die ZnS-Schicht schützt den Kern vor Oxidation und verhindert das Auslaugen von CdSe in die umgebende Lösung. Diese Strategie verbessert zudem die Photolumineszenz-Ausbeute. Die Eigenschaften lassen sich über die Dicke der ZnS-Schutzschichten einstellen. Die Emission kolloidaler Quantenpunkte kann durch die Verwendung verschiedener Beschichtungsmittel wie ZnS, CdS, ZnSe, CdTe und PbSe vom UV-Vis- bis zum Infrarotbereich moduliert werden . Die Eigenschaften der Quantenpunkte können auch durch das Syntheseschema und durch Hochtemperatur-Lösungsmittel-/Ligandenmischungen, die die Nanokristalleigenschaften beeinflussen, gezielt eingestellt werden. Hochwertige Quantenpunkt-Kontrastmittel werden bei erhöhten Temperaturen erhalten; aufgrund ihrer geringen Wasserlöslichkeit ist ihre Anwendung als Zellmarker jedoch begrenzt. Eine weitere Funktionalisierung mit hydrophilen Liganden ist erforderlich. [ 76 ] [ 73 ]

Die Vorteile von Quantenpunkten (QDs) liegen in ihrer schnellen Wirkung; sie können Zielgewebe oder -zellen innerhalb von Sekunden markieren. In-vivo-Studien zeigen, dass QDs Krebszellen selektiv markieren und sich im Tumorgewebe anreichern. Mit QDs markierte Tumorzellen lassen sich mittels Multiphotonenmikroskopie verfolgen, während sie in das Lungengewebe eindringen. In beiden Studien ermöglichten Spektralbildgebung und Autofluoreszenz-Subtraktion die mehrfarbige In-vivo-Visualisierung von Zellen und Geweben. Ein wesentlicher Nachteil von QDs ist ihre relativ hohe Toxizität. Funktionalisierungen mit verschiedenen Substraten, die die Bioaffinität erhöhen und die Toxizität verringern, sind in Arbeit. Beispielsweise kann Schwefel aus der QD-Hülle reversible Disulfidbrücken mit einer Vielzahl organischer Verbindungen bilden. [ 77 ]

Magnetresonanztomographie

Beispiele für Metallchelate, die erfolgreich in Zellen eingebracht wurden

Die Magnetresonanztomographie (MRT) ist ein leistungsstarkes Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen wie Krebsmetastasen und Entzündungen. Dabei werden verschiedene Metallchelate eingesetzt . Metallchelate erhöhen den Kontrast zwischen gesundem und erkranktem Gewebe, indem sie die Relaxation von Wasserstoffprotonen in ihrer unmittelbaren Umgebung katalysieren. Typische Beispiele sind niedermolekulare Gd³⁺-Chelate und superparamagnetisches Eisenoxid (SPIO). Die In-vivo -Verabreichung dieser Substanzen ermöglicht die Markierung von Tumorzellen. Alternativ können Zellen in vitro mit Kontrastmitteln markiert und anschließend in vivo injiziert und mittels MRT-Techniken überwacht werden. [ 78 ] [ 79 ] [ 80 ]

SPIO-Nanopartikel verleihen der MRT eine hohe Sensitivität, weisen jedoch eine geringere Affinität zu Zellen auf und sind erst bei hohen Konzentrationen wirksam. Funktionalisierungen dieser Verbindungen mit dendritischen Guanidinen zeigten ähnliche Aktivitäten wie TAT-basierte CPPs, jedoch eine höhere Toxizität. Neue Substrate auf Basis von Dendronen mit Hydroxyl- oder Amin-Peripherie weisen eine geringe Toxizität auf. SPIO werden unter anderem zur Zellmarkierung in vivo eingesetzt ; aufgrund ihrer geringen Toxizität sind sie klinisch für die Bildgebung von Leber , Milz und Gastrointestinaltrakt zugelassen. [ 81 ]

Das Vorhandensein von Argininresten im Oktamer ermöglicht die Transduktion verschiedener Frachtmoleküle, darunter Peptide, DNA, siRNA und Kontrastmittel, durch die Zellmembran. Die Fähigkeit zur Membranpassage ist jedoch nicht unidirektional; Arginin-basierte CPPs können die Zellmembran sowohl passieren als auch durchdringen, was zu einer mit der Zeit abnehmenden Konzentration des Kontrastmittels und einem sinkenden MRT-Signal führt. Dies schränkt ihre Anwendung in vivo ein . Um dieses Problem zu lösen, verbessern Kontrastmittel mit Disulfidbrücken – reversiblen Bindungen zwischen Metallchelat und Transduktionsgruppe – die zellassoziierte Retention. Die Disulfidbrücke wird durch die Umgebung der Zielzelle reduziert, und das Metallchelat verbleibt im Zytoplasma, wodurch die Verweildauer des Chelats in der Zielzelle verlängert wird. [ 82 ] [ 83 ] [ 84 ] [ 85 ]

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