Die Durchflusszytometrie ( FC ) ist eine Technik zur Detektion und Messung der physikalischen und chemischen Eigenschaften einer Zell- oder Partikelpopulation. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]

Bei diesem Verfahren wird eine Probe, die Zellen oder Partikel enthält, in einer Flüssigkeit suspendiert und in das Durchflusszytometer injiziert . Die Probe wird so fokussiert, dass idealerweise jeweils eine Zelle durch einen Laserstrahl fließt. Das gestreute Licht ist charakteristisch für die Zellen und ihre Bestandteile. Zellen werden häufig mit Fluoreszenzmarkern markiert, sodass das Licht absorbiert und anschließend in einem bestimmten Wellenlängenbereich emittiert wird. Zehntausende von Zellen können schnell untersucht werden, und die gesammelten Daten werden von einem Computer verarbeitet. [ 5 ]

Die Durchflusszytometrie wird routinemäßig in der Grundlagenforschung, der klinischen Praxis und in klinischen Studien eingesetzt . Zu den Anwendungsgebieten der Durchflusszytometrie gehören:

Ein Durchflusszytometer ist ein Gerät, das quantifizierbare Daten aus einer Probe liefert. Zu den weiteren Geräten, die Durchflusszytometrie nutzen, gehören Zellsortierer, die Zellen von Interesse anhand ihrer optischen Eigenschaften physikalisch trennen und dadurch reinigen.

Geschichte

Das erste impedanzbasierte Durchflusszytometer, das auf dem Coulter-Prinzip beruhte , wurde 1953 im US-Patent 2,656,508 von Wallace H. Coulter offenbart . Mack Fulwyler erfand den Vorläufer der heutigen Durchflusszytometer – insbesondere des Zellsorters. [ 6 ] Fulwyler entwickelte diesen 1965 und veröffentlichte seine Ergebnisse in der Fachzeitschrift Science . [ 7 ] Das erste fluoreszenzbasierte Durchflusszytometer (ICP 11) wurde 1968 von Wolfgang Göhde von der Universität Münster entwickelt , am 18. Dezember 1968 patentiert [ 8 ] und 1968/69 vom deutschen Entwickler und Hersteller Partec über die Phywe AG in Göttingen erstmals kommerzialisiert . Zu dieser Zeit bevorzugten viele Wissenschaftler noch Absorptionsmethoden gegenüber Fluoreszenzmethoden . [ 9 ] Kurz darauf wurden Durchflusszytometrie-Geräte entwickelt, darunter der Cytofluorograph (1971) von Bio/Physics Systems Inc. (später: Ortho Diagnostics), der PAS 8000 (1973) von Partec, das erste FACS-Gerät (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung) von Becton Dickinson (1974), der ICP 22 (1975) von Partec/Phywe und der Epics von Coulter (1977/78). Das erste markierungsfreie Hochfrequenz- Impedanz-Durchflusszytometer auf Basis eines patentierten mikrofluidischen „Lab-on-a-Chip“, der Ampha Z30, wurde 2012 von Amphasys vorgestellt.

Name der Technologie

Die ursprüngliche Bezeichnung für die fluoreszenzbasierte Durchflusszytometrie lautete „Impulszytophotometrie“ und basierte auf der ersten Patentanmeldung für diese Technologie . Auf der 5. Konferenz der American Engineering Foundation über automatisierte Zytologie in Pensacola (Florida) im Jahr 1976 – acht Jahre nach der Einführung des ersten fluoreszenzbasierten Durchflusszytometers (1968) – einigte man sich auf die allgemeine Bezeichnung „Durchflusszytometrie“, die sich schnell durchsetzte. [ 10 ]

Durchflusszytometer

Schematische Darstellung eines Durchflusszytometers, von der Fokussierung der Membran bis zur Datenerfassung.

Moderne Durchflusszytometer können viele Tausend Partikel pro Sekunde in Echtzeit analysieren und, wenn sie als Zellsortierer konfiguriert sind, Partikel mit spezifischen optischen Eigenschaften aktiv und mit ähnlicher Geschwindigkeit trennen und isolieren. Ein Durchflusszytometer ähnelt einem Mikroskop , mit dem Unterschied, dass die Durchflusszytometrie anstelle eines Zellbildes eine automatisierte Hochdurchsatz- Quantifizierung spezifischer optischer Parameter auf Zellebene ermöglicht. Zur Analyse von festem Gewebe muss zunächst eine Einzelzellsuspension hergestellt werden. [ 11 ]

Ein Durchflusszytometer besteht aus fünf Hauptkomponenten: einer Durchflusszelle, einem Messsystem, einem Detektor, einem Verstärkungssystem und einem Computer zur Signalanalyse. Die Durchflusszelle enthält einen Flüssigkeitsstrom (Hüllflüssigkeit), der die Zellen transportiert und ausrichtet, sodass sie einzeln durch den Lichtstrahl zur Messung fließen. Das Messsystem nutzt üblicherweise Impedanz- (oder Leitfähigkeits-) Messungen und optische Systeme – Lampen ( Quecksilber- , Xenon- ), Hochleistungslaser ( Argon- , Krypton- , Farbstofflaser), Niedrigleistungslaser (Argon (488 nm), rotes HeNe (633 nm), grünes HeNe, HeCd (UV)) und Diodenlaser (blau, grün, rot, violett). Die so erzeugten Lichtsignale werden vom Detektor und dem Analog-Digital-Wandler (ADC) erfasst. Dieser wandelt analoge Messwerte des vorwärtsgestreuten (FSC) und seitwärtsgestreuten (SSC) Lichts sowie farbstoffspezifische Fluoreszenzsignale in digitale Signale um, die vom Computer verarbeitet werden können. Das Verstärkungssystem kann linear oder logarithmisch sein .

Die Datenerfassung von Proben mittels Durchflusszytometrie wird als „Datenerfassung“ bezeichnet. Die Datenerfassung erfolgt über einen Computer, der physisch mit dem Durchflusszytometer verbunden ist, und die zugehörige Software, die die digitale Schnittstelle steuert. Die Software kann Parameter (z. B. Spannung, Kompensation) für die jeweilige Probe anpassen und zeigt während der Datenerfassung die Ausgangsinformationen der Probe an, um die korrekte Parametereinstellung sicherzustellen. Frühe Durchflusszytometer waren hauptsächlich experimentelle Geräte, doch technologische Fortschritte haben mittlerweile breite Anwendungsmöglichkeiten in Klinik und Forschung ermöglicht. Aufgrund dieser Entwicklungen ist ein bedeutender Markt für Instrumente, Analysesoftware sowie Reagenzien für die Datenerfassung, wie beispielsweise fluoreszenzmarkierte Antikörper, entstanden.

Moderne Geräte verfügen üblicherweise über mehrere Laser und Fluoreszenzdetektoren. Der aktuelle Rekord für ein kommerzielles Gerät liegt bei zehn Lasern [ 12 ] und 30 Fluoreszenzdetektoren [ 13 ] . Durch die Erhöhung der Anzahl von Lasern und Detektoren können mehrere Antikörper markiert und eine Zielpopulation anhand ihrer phänotypischen Marker präziser identifiziert werden. Bestimmte Geräte können sogar digitale Bilder einzelner Zellen aufnehmen und so die Position des Fluoreszenzsignals innerhalb oder auf der Zelloberfläche analysieren.

Hardware

Fluidiksystem eines Durchflusszytometers

Um die optischen Eigenschaften von Zellen in einem Durchflusszytometer präzise zu messen, müssen diese gleichmäßig durch das Zentrum fokussierter Laserstrahlen transportiert werden. [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] Das Fluidiksystem dient dazu, die Zellen einzeln durch den Laserstrahl und durch das gesamte Gerät zu befördern. In einem Durchflusszytometer mit Zellsortierfunktion wird der Fluidikstrom auch genutzt, um sortierte Zellen in Sammelröhrchen oder -kammern zu transportieren. [ 14 ]

Hydrodynamische Fokussierung

Zur präzisen Positionierung von Zellen in einem Flüssigkeitsstrahl wird in den meisten Zytometern die hydrodynamische Fokussierung eingesetzt. [ 14 ] [ 15 ] Die suspendierten Zellen gelangen, umschlossen von einer äußeren Hüllflüssigkeit, in das Gerät. Der Probenkern befindet sich im Zentrum dieser Hüllflüssigkeit. Die Probenzufuhrrate, also die Geschwindigkeit, mit der die Zellen zur Laserabtastung gelangen, lässt sich über den Druck der Hüllflüssigkeit auf den Probenkern steuern. Unter optimalen Bedingungen vermischen sich der zentrale Flüssigkeitsstrom und die Hüllflüssigkeit nicht.

Akustisch unterstützte hydrodynamische Fokussierung

Die akustische Fokussierungstechnologie wird in einigen Durchflusszytometern zur Unterstützung der hydrodynamischen Fokussierung eingesetzt. [ 14 ] [ 16 ] Akustische Wellen (>2 MHz) fokussieren die Probe vor der Einleitung in die Hüllflüssigkeit. Die vorfokussierte Probe wird anschließend in den hydrodynamischen Kern injiziert und durch das Gerät geleitet. Dies kann die Datengenauigkeit bei hohen Probenzufuhrraten erhöhen.

Optik und Elektronik

Optische Filter

Das von Fluorophoren emittierte Licht weist ein breites Wellenlängenspektrum auf, sodass die Kombination mehrerer Fluorophore zu Überlappungen führen kann. Um die Spezifität zu erhöhen, werden optische Filter und dichroitische Spiegel eingesetzt, um das Licht zu filtern und zu Detektoren wie Photomultiplier-Röhren (PMTs) oder Avalanche-Photodioden (APDs) zu lenken. [ 14 ] Optische Filter werden als Bandpass- (BP), Langpass- (LP) oder Kurzpassfilter (SP) ausgeführt. Die meisten Durchflusszytometer verwenden dichroitische Spiegel und Bandpassfilter, um spezifische Bereiche des optischen Spektrums auszuwählen.

Prismen, Gitter und spektrale Durchflusszytometrie

Die spektrale Durchflusszytometrie nutzt Prismen oder Beugungsgitter, um das emittierte Licht eines Markers auf einem Detektorarray zu verteilen. [ 14 ] [ 17 ] Dadurch können die vollständigen Spektren jedes einzelnen Partikels gemessen werden. Die gemessenen Spektren einzelner Zellen werden anschließend mithilfe von Referenzspektren aller verwendeten Farbstoffe und des Autofluoreszenzspektrums entmischt. Dies ermöglicht unter Umständen ein breiteres Spektrum an Markern und die Anwendung neuer biologischer Marker.

Bildgebende Durchflusszytometrie

Die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) erfasst Mehrkanalbilder von Zellen. [ 14 ] [ 18 ] Die in Bildgebungsplattformen verwendeten Detektoren können mit ladungsgekoppelten Bauelementen (CCD) oder komplementären Metall-Oxid-Halbleitern (CMOS) ausgestattet sein, um Bilder einzelner Zellen aufzunehmen.

Datenanalyse

Entschädigung

Jeder Fluorochrom besitzt ein breites Fluoreszenzspektrum. Werden mehrere Fluorochrome verwendet, kann es zu einer Überlappung ihrer Spektren kommen. Diese sogenannte Spektrumüberlappung muss korrigiert werden. Beispielsweise überlappt das Emissionsspektrum von FITC und PE die Wellenlänge des vom Fluorescein emittierten Lichts, wenn dieses den für PE verwendeten Filter passiert. Diese spektrale Überlappung wird korrigiert, indem ein Teil des FITC-Signals vom PE-Signal subtrahiert wird oder umgekehrt. Dieser Prozess wird als Farbkompensation bezeichnet und berechnet den Fluoreszenzanteil eines Fluorochroms als prozentualen Wert. [ 19 ]

Die Kompensation ist das mathematische Verfahren zur Korrektur spektraler Überlappungen in durchflusszytometrischen Daten mit mehreren Parametern. Da Fluorochrome ein breites Spektrum aufweisen können, kommt es zu Überlappungen, die bei der Datenanalyse zu unerwünschten Ergebnissen führen. Diese Überlappung, bekannt als Spillover und quantifiziert durch den Spillover-Koeffizienten, entsteht üblicherweise dadurch, dass Detektoren für ein bestimmtes Fluorochrom einen signifikanten Peak bei einer bestimmten Wellenlänge eines anderen Fluorochroms messen. Zur Korrektur wird meist lineare Algebra verwendet. [ 19 ]

Im Allgemeinen werden Diagramme mit einem oder mehreren Parametern angezeigt, um zu verdeutlichen, dass die anderen Parameter keinen Einfluss auf die dargestellte Verteilung haben. Dieses Problem tritt besonders bei Parametern mit mehr als zwei Dimensionen auf. Derzeit gibt es keine effizienten Methoden zur Darstellung mehrdimensionaler Parameter. Eine Kompensation ist jedoch wichtig, um die Unterschiede zwischen den Zellen sichtbar zu machen.

Analyse einer marinen Probe von photosynthetischem Picoplankton mittels Durchflusszytometrie, die drei verschiedene Populationen zeigt ( Prochlorococcus , Synechococcus und Picoeukaryoten ).

Toranlage

Durchflusszytometrie zur Einteilung von Blutzellen in Hauptkategorien anhand von Seitwärtsstreuung und CD45 bei normalverteilten Blutzellen.

Die von Durchflusszytometern erzeugten Daten können eindimensional als Histogramm , zweidimensional als Punktwolke oder sogar dreidimensional dargestellt werden. Die Bereiche dieser Darstellungen lassen sich anhand der Fluoreszenzintensität sequenziell trennen , indem man eine Reihe von Teilmengen, sogenannte „Gates“, extrahiert. Für diagnostische und klinische Zwecke, insbesondere in der Hämatologie , existieren spezifische Gating- Protokolle . Einzelne Zellen werden häufig von Zelldubletten oder größeren Aggregaten durch ihre Laufzeit (auch als „Pulsbreite“ bezeichnet) im eng fokussierten Laserstrahl unterschieden [ 20 ].

Die Diagramme werden häufig auf logarithmischen Skalen erstellt. Da sich die Emissionsspektren verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe überlappen [ 21 , 22 ], müssen die Signale an den Detektoren sowohl elektronisch als auch rechnerisch kompensiert werden. Die mit dem Durchflusszytometer erfassten Daten können mithilfe von Software analysiert werden. Nach der Datenerfassung ist keine Verbindung zum Durchflusszytometer mehr erforderlich; die Analyse erfolgt meist auf einem separaten Computer. Dies ist insbesondere in zentralen Forschungseinrichtungen notwendig, in denen die Nutzung dieser Geräte stark nachgefragt wird.

Computergestützte Analyse

Jüngste Fortschritte bei der automatisierten Populationsidentifizierung mittels computergestützter Methoden bieten eine Alternative zu traditionellen Gating-Strategien. Automatisierte Identifizierungssysteme könnten potenziell zur Entdeckung seltener und verborgener Populationen beitragen. Repräsentative automatisierte Methoden sind FLOCK [ 23 ] im Immunology Database and Analysis Portal (ImmPort) [ 24 ] , SamSPECTRAL [ 25 ] und flowClust [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ] in Bioconductor sowie FLAME [ 29 ] in GenePattern . T-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (tSNE) ist ein Algorithmus zur Dimensionsreduktion , der die Visualisierung komplexer, mehrdimensionaler Daten in einer zweidimensionalen „Karte“ ermöglicht [ 30 ] . Durch gemeinsame Anstrengungen entstand das Open-Source-Projekt FlowCAP (Flow Cytometry: Critical Assessment of Population Identification Methods [ 31 ] ), das einen objektiven Vergleich und eine objektive Bewertung von Clustering-Methoden für Durchflusszytometrie-Daten ermöglicht und Richtlinien für deren sachgemäße Anwendung bereitstellt.

FMO-Steuerungen

Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen (FMO-Kontrollen) sind wichtig für die Dateninterpretation beim Erstellen von Mehrfarbenpanels, bei denen eine Zelle gleichzeitig mit mehreren Fluorochromen angefärbt wird. FMO-Kontrollen messen die Fluoreszenzüberlappung in einem bestimmten Kanal und ermöglichen deren Kompensation. Zur Erstellung einer FMO-Kontrolle wird eine Probe mit allen Fluorochromen außer dem zu testenden angefärbt. Das heißt, bei Verwendung von vier verschiedenen Fluorochromen darf die FMO-Kontrolle nur drei davon enthalten (Beispiel: Fluorochrome A, B, C, D; FMOs ABC_, AB_D, A_CD, _BCD).

Zellsortierung mittels Durchflusszytometrie

Die Zellsortierung ist eine Methode zur Reinigung von Zellpopulationen anhand des Vorhandenseins oder Fehlens spezifischer physikalischer Merkmale. [ 14 ] [ 16 ] [ 32 ] In Durchflusszytometern mit Sortierfunktion detektiert das Gerät Zellen anhand von Parametern wie Zellgröße, Morphologie und Proteinexpression. Anschließend werden die Zellen mithilfe der Tröpfchentechnologie sortiert und die Subpopulationen für die weitere Verwendung nach dem Experiment gewonnen. [ 14 ] [ 16 ]

Der erste Prototyp eines Zellsorters wurde 1965 im Los Alamos National Laboratory (LANL) von dem Physiker Mack J. Fulwyler gebaut, indem er einen Coulter-Volumensensor mit dem neu erfundenen Tintenstrahldrucker kombinierte. [ 33 ] Der Lebendzellsorter oder fluoreszenzaktivierte Zellsorter (FACS) [ a ] ​​wurde von Len Herzenberg entwickelt, der 2006 für seine bahnbrechende Arbeit den Kyoto-Preis erhielt . [ 35 ]

Zellsortierung mittels Durchflusszytometrie und Tröpfchentechnologie

Im Gegensatz zu Durchflusszytometrie-Analysatoren verfügen Zellsortierer für die Durchflusszytometrie über ein separates Sammelsystem. Der Sammelprozess beginnt mit der Injektion einer Probe in einen Hüllflüssigkeitsstrom, der durch die Durchflusszelle strömt und von einem Laser erfasst wird. [ 36 ]  Der Strom transportiert die Zellen anschließend durch eine vibrierende Düse, die Tröpfchen erzeugt, von denen die meisten entweder nur eine Zelle oder keine Zellen enthalten. Ein elektrischer Ladering befindet sich genau an der Stelle, an der der Strom in Tröpfchen zerfällt. Unmittelbar vor der Messung der Fluoreszenzintensität wird der Ring aufgeladen . Die entgegengesetzte Ladung wird beim Ablösen des Tröpfchens vom Strom eingefangen, wodurch die Tröpfchen geladen werden. Die geladenen Tröpfchen durchlaufen dann ein elektrostatisches Ablenksystem , das sie anhand ihrer Ladung in verschiedene Behälter leitet. In manchen Systemen wird die Ladung direkt auf den Strom aufgebracht, sodass das ablösende Tröpfchen die gleiche Ladung wie der Strom trägt. Nach dem Ablösen des Tröpfchens wird der Strom wieder neutralisiert. Die gesammelten Zellen können anschließend weiter kultiviert, manipuliert und untersucht werden.

Etiketten

Anwendung der Durchflusszytometrie zur Messung der Kopienzahlvariation einer spezifischen DNA-Sequenz ( Flow-FISH )

Die Durchflusszytometrie nutzt die Lichtstreuung von Zellen oder Partikeln zur Identifizierung oder quantitativen Messung physikalischer Eigenschaften. Markierungen, Farbstoffe und Färbemittel ermöglichen die multiparametrische Analyse (um mehr über die Eigenschaften einer Zelle zu erfahren). Die Immunphänotypisierung ist die Analyse heterogener Zellpopulationen mithilfe markierter Antikörper [ 37 ] und anderer fluorophorhaltiger Reagenzien wie Farbstoffen und Färbemitteln.

Fluoreszierende Etiketten

Eine Vielzahl von Fluorophoren kann als Marker in der Durchflusszytometrie eingesetzt werden. [ 21 ] Fluorophore, kurz „Fluors“, werden typischerweise an einen Antikörper gebunden, der ein Zielmerkmal auf oder in der Zelle erkennt. Alternativ können sie auch an eine chemische Substanz mit Affinität zur Zellmembran oder einer anderen Zellstruktur gebunden werden. Jeder Fluorophor besitzt eine charakteristische Anregungs- und Emissionswellenlänge , wobei sich die Emissionsspektren häufig überlappen. Die Kombinationsmöglichkeiten der Marker hängen daher von der Wellenlänge der zur Anregung der Fluorochrome verwendeten Lampen oder Laser sowie von den verfügbaren Detektoren ab. [ 38 ] Die Durchflusszytometrie nutzt Fluoreszenz als quantitatives Werkzeug. Ihre höchste Empfindlichkeit ist im Vergleich zu anderen Fluoreszenzdetektionsplattformen wie der Konfokalmikroskopie unerreicht . Die absolute Fluoreszenzempfindlichkeit ist in der Konfokalmikroskopie generell geringer , da Signale außerhalb des Fokus vom konfokalen optischen System unterdrückt werden und das Bild seriell aus Einzelmessungen an jeder Stelle der Zelle aufgebaut wird. Dies reduziert die zur Signalerfassung verfügbare Zeit. [ 39 ]

Quantenpunkte

Quantenpunkte werden aufgrund ihrer schmaleren Emissionsspitzen manchmal anstelle herkömmlicher Fluorophore verwendet.

Isotopenmarkierung

Die Massenzytometrie überwindet die Grenzen der Fluoreszenzmarkierung durch die Verwendung von an Antikörper gebundenen Lanthanidisotopen . Theoretisch könnten mit dieser Methode 40 bis 60 verschiedene Markierungen verwendet werden; dies wurde bereits für 30 Markierungen demonstriert. [ 40 ] Die Massenzytometrie unterscheidet sich grundlegend von der Durchflusszytometrie: Zellen werden in ein Plasma eingebracht, ionisiert und die assoziierten Isotope mittels Flugzeitmassenspektrometrie quantifiziert . Obwohl diese Methode die Verwendung einer großen Anzahl von Markierungen ermöglicht, weist sie derzeit eine geringere Durchsatzkapazität als die Durchflusszytometrie auf. Zudem werden die analysierten Zellen zerstört, wodurch eine spätere Zellsortierung nicht mehr möglich ist. [ 40 ]

Zytometrisches Bead-Array

Neben der Möglichkeit, einzelne Zellen mittels fluoreszierender Antikörper zu markieren und zu identifizieren, können auch zelluläre Produkte wie Zytokine, Proteine ​​und andere Faktoren gemessen werden. Ähnlich wie bei ELISA- Sandwich-Assays verwenden Zytometrie-Bead-Array-Assays ( CBA ) mehrere Bead-Populationen, die sich typischerweise in Größe und Fluoreszenzintensität unterscheiden, um mehrere Analyten in einem einzigen Assay zu differenzieren. Die Menge des gebundenen Analyten wird mittels eines biotinylierten Antikörpers gegen ein sekundäres Epitop des Proteins und anschließender Behandlung mit Streptavidin-R-Phycoerythrin detektiert. Die Fluoreszenzintensität von R-Phycoerythrin auf den Beads wird mit einem Durchflusszytometer mit einer 488-nm-Anregungsquelle quantifiziert. Die Konzentrationen eines Proteins von Interesse in den Proben können durch Vergleich der Fluoreszenzsignale mit denen einer Standardkurve bestimmt werden, die durch serielle Verdünnung einer bekannten Analytkonzentration erstellt wurde. Häufig wird dieses Verfahren auch als Zytokin-Bead-Array (CBA) bezeichnet.

Impedanz-Durchflusszytometrie

Impedanzbasierte Einzelzellanalysesysteme sind allgemein als Coulter-Zähler bekannt . Sie stellen eine etablierte Methode zur Zählung und Größenbestimmung nahezu aller Arten von Zellen und Partikeln dar. Die markierungsfreie Technologie wurde kürzlich durch einen „ Lab-on-a-Chip “-Ansatz und die Anwendung von hochfrequentem Wechselstrom (AC) im Radiofrequenzbereich (von 100 kHz bis 30 MHz) anstelle von statischem Gleichstrom (DC) oder niederfrequentem Wechselstromfeld verbessert. [ 41 ] [ 42 ] Diese patentierte Technologie ermöglicht eine hochpräzise Zellanalyse und liefert zusätzliche Informationen wie Membrankapazität und Viabilität . Die relativ geringe Größe und Robustheit ermöglichen den batteriebetriebenen Einsatz vor Ort.

Messbare Parameter

Messbare Faktoren in der Zellanalyse und Durchflusszytometrie umfassen eine Vielzahl von Merkmalen und Indikatoren, die wichtige Einblicke in die Zellbiologie und -funktion ermöglichen. Durchflusszytometrische Verfahren können diese Faktoren quantifizieren und auswerten und erlauben Forschern so die Untersuchung und Analyse verschiedener Aspekte von Zellen. Im Folgenden werden einige wichtige, häufig untersuchte quantifizierbare Parameter aufgeführt:

  • Apoptose: Die Apoptose lässt sich mittels Durchflusszytometrie quantifizieren, indem DNA-Abbau, mitochondriales Membranpotenzial, Permeabilitätsveränderungen und Caspase-Aktivität gemessen werden. Diese Messungen liefern wichtige Details über den geplanten Zelltod.
  • Zelladhäsion: Mithilfe der Durchflusszytometrie lässt sich die Zelladhäsion, beispielsweise die Adhäsion von Krankheitserregern an Wirtszellen, untersuchen. Forscher können Zelladhäsionsereignisse quantifizieren und analysieren, indem sie spezifische Marker oder Fluoreszenzmarkierungen verwenden.
  • Zellpigmente: Chlorophyll und Phycoerythrin sind Pigmente, die in bestimmten Zellen vorkommen. Das Vorkommen und die Menge dieser Pigmente lassen sich mittels Durchflusszytometrie messen und liefern so Informationen über den Zellstoffwechsel und physiologische Zustände.
  • Zelloberflächenantigene: Die Durchflusszytometrie wird häufig zur Identifizierung und Quantifizierung von Zelloberflächenantigenen, auch bekannt als Cluster-of-Differentiation-Marker (CD-Marker), eingesetzt. Forscher können Zellpopulationen anhand der Expression von Oberflächenantigenen klassifizieren, indem sie Zellen mit spezifischen Antikörpern markieren.
Die Durchflusszytometrie mit 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) ergab, dass ein niedrigeres Signal auf lebensfähige Zellen hinweist. Daher zeigt dieser Fall eine gute Lebensfähigkeit.
  • Zellviabilität: Die Durchflusszytometrie kann zur Bestimmung der Zellviabilität eingesetzt werden , indem Fluoreszenzfarbstoffe oder Marker verwendet werden, die zwischen lebenden und toten Zellen unterscheiden. Dieser Parameter ist entscheidend für die Beurteilung des Zellzustands und der Reaktion auf experimentelle oder therapeutische Maßnahmen. Die Zellviabilität in der Durchflusszytometrie sollte etwa 95 % betragen, jedoch nicht unter 90 % liegen. [ 43 ]
  • Zirkulierende Tumorzellen: Die Durchflusszytometrie ist unerlässlich für die Isolierung und Reinigung zirkulierender Tumorzellen (CTCs) aus Blutproben. CTCs können durch die Analyse bestimmter Marker oder Merkmale identifiziert und untersucht werden und unterstützen so die Krebsdiagnose, Prognose und Therapiekontrolle.
  • Charakterisierung von Multiresistenz (MDR): Mithilfe der Durchflusszytometrie lässt sich Multiresistenz (MDR) in Krebszellen charakterisieren, indem der Ausstrom von Fluoreszenzfarbstoffen oder spezifischen Markern, die mit Resistenzmechanismen assoziiert sind, analysiert wird. Diese Erkenntnisse tragen zum Verständnis und zur Bekämpfung von Medikamentenresistenzen in der Krebstherapie bei.
  • Chromosomenanalyse und -sortierung: Die Durchflusszytometrie kann bei der Chromosomenanalyse und -sortierung helfen und ermöglicht die Erstellung von Bibliotheken sowie die Identifizierung spezifischer Chromosomen oder chromosomaler Anomalien.
  • Variation der DNA-Kopienzahl: Die Variation der DNA-Kopienzahl kann mithilfe von Durchflusszytometrie-Techniken wie Flow-FISH oder der BACs-on-Beads-Technologie gemessen werden. Diese Technologien liefern Erkenntnisse über genetische Veränderungen, die mit Krankheiten wie Krebs in Verbindung stehen.
  • Proteinexpression und -modifikationen: Mithilfe fluoreszenzmarkierter Antikörper oder Sonden ermöglicht die Durchflusszytometrie die Bestimmung der Proteinexpression und von Veränderungen wie der Phosphorylierung. Dieser Parameter trägt zu einem besseren Verständnis der Proteinfunktion und von Signalnetzwerken bei.
  • Membranfluidität: Mithilfe der Durchflusszytometrie lässt sich die Membranfluidität durch den Einsatz von Fluoreszenzsonden, die empfindlich auf Membraneigenschaften reagieren, bestimmen. Dieser Parameter liefert Informationen über die Dynamik und Funktion von Zellmembranen.
  • Gesamt-DNA- und RNA-Gehalt: Mittels Durchflusszytometrie lässt sich der Gesamt-DNA- und RNA-Gehalt in Zellen messen. Diese Daten sind nützlich für Zellzyklusanalysen, Proliferationsuntersuchungen und die Bestimmung von Genexpressionsänderungen.
  • Überwachung intrazellulärer Parameter: Intrazelluläre Faktoren wie pH-Wert, intrazelluläre Konzentrationen von ionisiertem Kalzium und Magnesium, Membranpotenzial, Glutathionspiegel und oxidativer Burst können mittels Durchflusszytometrie gemessen werden. Diese Daten liefern Informationen über Zellstoffwechsel, Signalwege und oxidativen Stress .
  • Lichtstreuung: In der Durchflusszytometrie werden Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitwärtsstreuung (SSC) gemessen, um das Zellvolumen bzw. die morphologische Komplexität zu bestimmen. Diese Messgrößen beschreiben Größe, Granularität und Form der Zellen.
  • Transgene Produkte: Die Durchflusszytometrie eignet sich zur Untersuchung transgener Produkte in vivo, insbesondere von fluoreszierenden Proteinen wie dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) oder ähnlichen Varianten. Sie ermöglicht es Wissenschaftlern, Genexpression, Proteinlokalisierung und zelluläre Dynamik zu erforschen.
  • Verschiedene Kombinationsmöglichkeiten: Die Durchflusszytometrie ermöglicht die Integration vieler messbarer Daten, wie z. B. DNA/Oberflächenantigene, um ein umfassendes Verständnis biologischer Merkmale und Funktionen zu erlangen. [ 44 ]

Anwendungen

Die Technologie findet Anwendung in verschiedenen Bereichen, darunter Molekularbiologie , Pathologie , Immunologie , Virologie [ 45 ] , Pflanzenbiologie und Meeresbiologie [ 46 ] . Sie wird in der Medizin , insbesondere in der Transplantation, Hämatologie, Tumorimmunologie und Chemotherapie, Pränataldiagnostik, Genetik und Spermiensortierung zur Geschlechtsbestimmung, breit eingesetzt . Die Durchflusszytometrie wird häufig zur Erkennung von Spermienanomalien im Zusammenhang mit DNA-Fragmentierung [ 47 ] und in Fertilitätsuntersuchungen eingesetzt [ 48 ] . Darüber hinaus findet sie breite Anwendung in der Forschung zur Erkennung von DNA-Schäden [ 49 , 50 ] , Caspase-Spaltung und Apoptose [ 51 ] . Die photoakustische Durchflusszytometrie wird in der Erforschung multiresistenter Bakterien (meist MRSA) eingesetzt, um mit gefärbten Bakteriophagen markierte Bakterien im Blut nachzuweisen, zu differenzieren und zu quantifizieren . [ 52 ] In den Neurowissenschaften kann die Koexpression von Zelloberflächen- und intrazellulären Antigenen analysiert werden. [ 53 ] In der Mikrobiologie kann sie zum Screening und Sortieren von Transposonmutantenbibliotheken eingesetzt werden, die mit einem GFP-kodierenden Transposon (TnMHA) konstruiert wurden, [ 54 ] oder zur Bestimmung der Lebensfähigkeit. [ 55 ] Im Protein-Engineering wird die Durchflusszytometrie in Kombination mit Hefe- und Bakterien-Display verwendet , um auf der Zelloberfläche präsentierte Proteinvarianten mit gewünschten Eigenschaften zu identifizieren. Die Hauptvorteile der Durchflusszytometrie gegenüber Histologie und IHC liegen in der Möglichkeit, die Mengen an Antigenen präzise zu messen und jede Zelle mit mehreren Antikörper-Fluorophoren anzufärben. In aktuellen Laboren können etwa 10 Antikörper an jede Zelle gebunden werden. Dies ist deutlich weniger als bei der Massenzytometrie, wo derzeit bis zu 40 gemessen werden können, allerdings zu höheren Kosten und mit geringerer Messgeschwindigkeit.

Wasserforschung

In aquatischen Systemen wird die Durchflusszytometrie zur Analyse von autofluoreszierenden Zellen oder Zellen, die mit Farbstoffen fluoreszierend markiert wurden, eingesetzt. Diese Forschung begann 1981, als Clarice Yentsch die Fluoreszenz in einer Algenblüte verursachenden Dinoflagellatenart mittels Durchflusszytometrie maß. [ 56 ] Im darauffolgenden Jahr veröffentlichten Forscher durchflusszytometrische Messungen an verschiedenen Algenarten, die sich anhand ihrer Fluoreszenzeigenschaften unterscheiden ließen. [ 57 ] Bis 1983 bauten Meeresforscher eigene Durchflusszytometer [ 58 ] oder nutzten kommerziell erhältliche Geräte an Meerwasserproben, die vor Bermuda gesammelt wurden. Sie konnten so zeigen, dass Phytoplanktonzellen von nicht-lebendem Material unterschieden und Cyanobakterien aus einer gemischten Gemeinschaft isoliert und anschließend im Labor kultiviert werden konnten. [ 59 ] Die Durchflusszytometrie ermöglichte es Meeresforschern außerdem, zwischen schwach fluoreszierenden Prochlorococcus-Arten und heterotrophen Mikroorganismen zu unterscheiden – eine Unterscheidung, die mit mikroskopischen Methoden schwierig ist. [ 60 ] Fortschritte in der Technologie ermöglichen es aquatischen Wissenschaftlern nun, Durchflusszytometer kontinuierlich während Forschungsfahrten einzusetzen [ 61 ]. Durchflusszytometer werden auch verwendet, um Bilder einzelner Phytoplanktonzellen zu liefern. [ 62 ] [ 63 ] Meereswissenschaftler nutzen die Sortierfähigkeit von Durchflusszytometern, um diskrete Messungen der zellulären Aktivität und Diversität durchzuführen [ 64 ] [ 65 ] , um die mutualistischen Beziehungen zwischen eng beieinander lebenden Mikroorganismen zu untersuchen [ 66 ] und um biogeochemische Raten verschiedener Prozesse im Ozean zu messen. [ 67 ]

Zellproliferationstest

Die Zellproliferation ist eine Hauptfunktion des Immunsystems. Um Schlussfolgerungen zu ziehen, ist es oft notwendig, die Proliferationsfähigkeit von Zellen zu analysieren. Ein Verfahren zur Bestimmung der Zellproliferation ist der Einsatz des Farbstoffs Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFSE). Dieser ermöglicht die Überwachung proliferierender Zellen und liefert sowohl quantitative als auch qualitative Daten in Zeitreihenexperimenten. [ 68 ] Der Farbstoff bindet kovalent an langlebige Moleküle im Zellinneren. Bei der Zellteilung teilen sich auch die Moleküle, sodass die Tochterzellen nur noch die Hälfte der Farbstoffmenge der Mutterzellen enthalten. Diese Abnahme der Farbstoffintensität lässt sich mittels Durchflusszytometrie visualisieren. [ 69 ] In der Literatur wird diese leistungsstarke Technik der Durchflusszytometrie in Kombination mit CFSE zur Bestimmung der Effizienz von T-Zellen bei der Abtötung von Zielzellen in Krebserkrankungen wie Leukämie eingesetzt. Um den Zelltod der Zielzellen, sowohl den schnellen als auch den langsamen, sichtbar zu machen, verwendeten Wissenschaftler CFSE-Markierung in Kombination mit Antikörperfärbung bestimmter Zelltypen und fluoreszenzmarkierten Mikrokügelchen. Dies lieferte auch Informationen über die Proliferation der Zielzellen nach der Behandlung mit bestimmten Zytokinen. [ 70 ]

Messung der Genomgröße

Die Durchflusszytometrie wird zur Messung von Genomgrößen , genauer gesagt der DNA -Menge in einer Zelle oder einem Zellkern , eingesetzt. Obwohl Genome durch Genomsequenzierung präziser analysiert werden können , ist dies aufgrund des hohen Anteils an Mikrochromosomen oder repetitiven Sequenzen , die bei der Sequenzierung möglicherweise nicht erfasst werden (oder im Analyseschritt herausgefiltert werden, wenn sie keinem Chromosom zugeordnet werden können ), oft schwierig. Allerdings ist auch die Durchflusszytometrie nicht perfekt. Die ermittelten Genomgrößen können je nach verwendetem Farbstoff variieren. Eine Analyse von Fischgenomen ergab signifikant unterschiedliche Genomgrößen bei Verwendung von Propidiumiodid (PI) bzw. DAPI . Beispielsweise enthielt das Genom von Anguilla japonica mit PI 1,09 pg DNA, mit DAPI hingegen nur 1,25 pg. Das Genom von Myxocyprinus asiaticus enthielt 2,75 pg DNA (PI) bzw. 3,08 pg (DAPI). Die Unterschiede lagen also in der Größenordnung von 12–14 %. [ 71 ]

Siehe auch

Anmerkungen

  1. ^ Das Akronym FACS ist eine eingetragene Marke und Eigentum von BD Biosciences-Immunocytometry Systems, einer Abteilung von Becton-Dickinson, die die Patente von Stanford lizenziert hat. [ 32 ] [ 34 ]

Referenzen

  1. ^ Picot J, Guerin CL, Le Van Kim C, Boulanger CM (März 2012). „Durchflusszytometrie: Rückblick, Grundlagen und aktuelle Instrumentierung“ . Cytotechnology . 64 ( 2): 109–30 . doi : 10.1007/s10616-011-9415-0 . PMC  3279584. PMID  22271369 .
  2. ^ „Durchflusszytometrie“ . TheFreeDictionary.com . Abgerufen am 18.09.2018 .
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