Knockout-Maus

Eine Knockout- Maus ( Mus musculus ) ist eine gentechnisch veränderte Maus, bei der Forscher ein vorhandenes Gen durch den Austausch oder die Unterbrechung durch ein künstliches DNA- Fragment inaktiviert haben. Knockout - Mäuse sind wichtige Tiermodelle zur Untersuchung der Rolle von Genen, deren Sequenz zwar bekannt ist, deren Funktion aber noch nicht vollständig aufgeklärt wurde. Indem ein bestimmtes Gen in der Maus inaktiviert wird und etwaige Abweichungen vom normalen Verhalten oder der Physiologie beobachtet werden, können Forscher auf dessen wahrscheinliche Funktion schließen.

Mäuse sind derzeit die Labortierart, die am engsten mit dem Menschen verwandt ist und bei der die Knockout-Technik leicht angewendet werden kann. Sie werden häufig in Knockout-Experimenten eingesetzt, insbesondere in solchen, die genetische Fragestellungen im Zusammenhang mit der menschlichen Physiologie untersuchen . Gen-Knockouts bei Ratten sind deutlich schwieriger und erst seit 2003 möglich. ^{[ 1 ] [ 2 ]}

Die erste dokumentierte Knockout-Maus wurde 1989 von Mario R. Capecchi , Martin Evans und Oliver Smithies entwickelt , wofür sie 2007 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin erhielten . Aspekte der Technologie zur Erzeugung von Knockout-Mäusen sowie die Mäuse selbst wurden in vielen Ländern von privaten Unternehmen patentiert .

Durch das Ausschalten eines Gens lässt sich dessen normale Funktion aufklären. Menschen und Mäuse teilen viele Gene. Daher liefert die Beobachtung der Eigenschaften von Knockout-Mäusen Forschern Informationen, die ihnen helfen können, besser zu verstehen, wie ein ähnliches Gen beim Menschen Krankheiten verursachen oder zu deren Entstehung beitragen kann.

Beispiele für Forschungsarbeiten, in denen Knockout-Mäuse nützlich waren, sind die Untersuchung und Modellierung verschiedener Krebsarten , Adipositas , Herzerkrankungen , Diabetes , Arthritis , Substanzmissbrauch , Angstzustände , Alterungsprozesse und Parkinson . Knockout-Mäuse bieten zudem einen biologischen und wissenschaftlichen Kontext, in dem Medikamente und andere Therapien entwickelt und getestet werden können.

Millionen von Knockout-Mäusen werden jedes Jahr in Experimenten eingesetzt. ^{[ 3 ]}

Es gibt mehrere tausend verschiedene Knockout-Mausstämme. ^{[ 3 ]} Viele Mausmodelle sind nach dem inaktivierten Gen benannt. Beispielsweise ist die p53- Knockout-Maus nach dem p53-Gen benannt, das für ein Protein kodiert, welches normalerweise das Tumorwachstum hemmt, indem es die Zellteilung stoppt und/oder Apoptose auslöst. Menschen mit Mutationen, die das p53-Gen deaktivieren, leiden am Li-Fraumeni-Syndrom , einer Erkrankung, die das Risiko, bereits in jungen Jahren an Knochen-, Brust- und Blutkrebs zu erkranken, drastisch erhöht. Andere Mausmodelle werden nach ihren körperlichen Merkmalen oder ihrem Verhalten benannt.

Es gibt verschiedene Verfahren zur Herstellung von Knockout-Mäusen; das Folgende ist ein typisches Beispiel.

1. Das auszuschaltende Gen wird aus einer Mausgenbibliothek isoliert . Anschließend wird eine neue DNA-Sequenz konstruiert, die dem ursprünglichen Gen und seiner unmittelbaren Nachbarsequenz sehr ähnlich ist, jedoch so verändert wurde, dass das Gen funktionsunfähig wird. Üblicherweise wird der neuen Sequenz auch ein Markergen hinzugefügt – ein Gen, das normale Mäuse nicht besitzen und das Resistenzen gegen ein bestimmtes toxisches Agens (z. B. Neomycin) vermittelt oder eine sichtbare Veränderung (z. B. Farbe oder Fluoreszenz) hervorruft. Zusätzlich wird ein zweites Gen, wie beispielsweise das Herpes-tk+-Gen, in das Konstrukt integriert, um eine vollständige Selektion zu gewährleisten.
2. Embryonale Stammzellen werden aus einer Mausblastozyste (einem sehr jungen Embryo ) isoliert und in vitro kultiviert . In diesem Beispiel verwenden wir Stammzellen einer weißen Maus.
3. Die neue Sequenz aus Schritt 1 wird mittels Elektroporation in die Stammzellen aus Schritt 2 eingebracht . Durch homologe Rekombination integrieren einige der elektroporierten Stammzellen die neue Sequenz zusammen mit dem ausgeschalteten Gen in ihre Chromosomen anstelle des ursprünglichen Gens. Da die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Rekombination relativ gering ist, tragen die meisten veränderten Zellen die neue Sequenz nur in einem der beiden relevanten Chromosomen – sie sind heterozygot . Zellen, die mit einem Vektor transformiert wurden, der das Neomycin-Resistenzgen und das Herpes-tk+-Gen enthält, werden in einer Lösung mit Neomycin und Ganciclovir kultiviert , um die durch homologe Rekombination entstandenen Transformationen zu selektieren. Zellen, deren DNA zufällig eingefügt wurde, sterben ab, da sie sowohl das Neomycin-Resistenzgen als auch das Herpes-tk+-Gen exprimieren. Dessen Genprodukt reagiert mit Ganciclovir und bildet ein tödliches Toxin. Darüber hinaus werden Zellen, die kein genetisches Material integrieren, negativ auf beide Gene getestet und sterben daher infolge einer Vergiftung mit Neomycin ab.
4. Die embryonalen Stammzellen, die das ausgeschaltete Gen aufgenommen haben, werden mithilfe des Markergens aus Schritt 1 von den unveränderten Zellen isoliert. Beispielsweise können die unveränderten Zellen mit einem toxischen Mittel abgetötet werden, gegen das die veränderten Zellen resistent sind.
5. Die in Schritt 4 erzeugten, ausgeschalteten embryonalen Stammzellen werden in eine Mausblastozyste eingesetzt . In diesem Beispiel verwenden wir Blastozysten einer grauen Maus. Die Blastozysten enthalten nun zwei Arten von Stammzellen: die ursprünglichen (von der grauen Maus) und die ausgeschalteten (von der weißen Maus). Diese Blastozysten werden dann in die Gebärmutter weiblicher Mäuse eingesetzt, wo sie sich entwickeln. Die neugeborenen Mäuse sind daher Chimären : Einige Körperteile stammen von den ursprünglichen Stammzellen, andere von den ausgeschalteten. Ihr Fell weist weiße und graue Flecken auf, wobei die weißen Flecken von den ausgeschalteten Stammzellen und die grauen Flecken von der Empfängerblastozyste stammen.
6. Einige der neugeborenen Chimärenmäuse besitzen Gonaden, die von ausgeschalteten Stammzellen abstammen, und produzieren daher Eizellen oder Spermien, die das ausgeschaltete Gen enthalten. Werden diese Chimärenmäuse mit Wildtyp-Mäusen gekreuzt, tragen einige ihrer Nachkommen eine Kopie des ausgeschalteten Gens in all ihren Zellen. Diese Mäuse enthalten keine DNA der grauen Maus und sind keine Chimären, aber dennoch heterozygot.
7. When these heterozygous offspring are interbred, some of their offspring will inherit the knocked-out gene from both parents; they carry no functional copy of the original unaltered gene (i.e. they are homozygous for that allele).

A detailed explanation of how knockout (KO) mice are created is located at the website of the Nobel Prize in Physiology or Medicine 2007.^[4]

The National Institutes of Health discusses some important limitations of this technique.^[5]

While knockout mouse technology represents a valuable research tool, some important limitations exist. About 15 percent of gene knockouts are developmentally lethal, which means that the genetically altered embryos cannot grow into adult mice. This problem is often overcome through the use of conditional mutations. The lack of adult mice limits studies to embryonic development and often makes it more difficult to determine a gene's function in relation to human health. In some instances, the gene may serve a different function in adults than in developing embryos.

Knocking out a gene also may fail to produce an observable change in a mouse or may even produce different characteristics from those observed in humans in which the same gene is inactivated. For example, mutations in the p53 gene are associated with more than half of human cancers and often lead to tumours in a particular set of tissues. However, when the p53 gene is knocked out in mice, the animals develop tumours in a different array of tissues.

There is variability in the whole procedure depending largely on the strain from which the stem cells have been derived. Generally cells derived from strain 129 are used. This specific strain is not suitable for many experiments (e.g., behavioural), so it is very common to backcross the offspring to other strains. Some genomic loci have been proven very difficult to knock out. Reasons might be the presence of repetitive sequences, extensive DNA methylation, or heterochromatin. The confounding presence of neighbouring 129 genes on the knockout segment of genetic material has been dubbed the "flanking-gene effect".^[6] Methods and guidelines to deal with this problem have been proposed.^[7][8]

Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass konventionelle (d. h. nicht-konditionelle) Knockout-Mäuse sich in Abwesenheit des untersuchten Gens entwickeln. Manchmal kann der Aktivitätsverlust während der Entwicklung die Rolle des Gens im adulten Zustand verschleiern, insbesondere wenn das Gen an zahlreichen Entwicklungsprozessen beteiligt ist. Daher sind konditionelle/induzierbare Mutationsansätze erforderlich, die es der Maus zunächst ermöglichen, sich normal zu entwickeln und auszureifen, bevor das betreffende Gen ausgeschaltet wird.

Eine weitere schwerwiegende Einschränkung ist das Fehlen evolutionärer Anpassungen im Knockout-Modell, die bei Wildtyp-Tieren nach einer natürlichen Mutation auftreten könnten. Beispielsweise stellt die erythrozytenspezifische Koexpression von GLUT1 mit Stomatin einen Kompensationsmechanismus bei Säugetieren dar, die nicht in der Lage sind, Vitamin C zu synthetisieren . ^{[ 9 ]}

• Chimäre (Genetik) § Arbeit mit Mäusen
• Gentechnisch veränderter Organismus
• Genetik
• Hummus
• Internationales Knockout-Maus-Konsortium
• Internationales Maus-Phänotypisierungs-Konsortium
• Knockout-Moos
• Oncomouse
• Wollmaus