Optischer Faserimmunoassay zur Umgebungsbeleuchtung

Der Surround-Optical-Fiber-Immunoassay ( SOFIA ) ist eine hochempfindliche In-vitro -Diagnostikplattform, die eine optische Faseranordnung nutzt, um die Fluoreszenzemissionen einer gesamten Probe zu erfassen . Die Technologie zeichnet sich durch ihre extrem hohe Nachweisgrenze , Empfindlichkeit und ihren großen dynamischen Bereich aus . Die Empfindlichkeit von SOFIA liegt im Attogramm- Bereich (10⁻¹⁸ ^g  ) und ist damit etwa eine Milliarde Mal empfindlicher als herkömmliche Diagnoseverfahren. Dank des erweiterten dynamischen Bereichs kann SOFIA Analytkonzentrationen in einer Probe über zehn Größenordnungen hinweg unterscheiden und ermöglicht so eine präzise Titerbestimmung .

Als diagnostische Plattform bietet SOFIA ein breites Anwendungsspektrum. Mehrere Studien haben bereits die beispiellose Fähigkeit von SOFIA demonstriert, natürlich vorkommende Prionen im Blut und Urin von Krankheitsträgern nachzuweisen. ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]} Dies dürfte zum ersten zuverlässigen Lebend -Screeningtest für vCJK , BSE , Scrapie , CWD und andere übertragbare spongiforme Enzephalopathien führen . ^{[ 4 ]} Aufgrund der extremen Sensitivität der Technologie werden weitere einzigartige Anwendungen erwartet, darunter In-vitro -Tests für andere neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson . ^{[ 3 ]}

SOFIA wurde im Rahmen eines gemeinsamen Forschungsprojekts zwischen dem Los Alamos National Laboratory und der State University of New York entwickelt und vom Nationalen Prionenforschungsprogramm des US-Verteidigungsministeriums unterstützt .

Die herkömmliche Methode zur Durchführung laserinduzierter Fluoreszenzmessungen sowie anderer Arten spektroskopischer Messungen, wie z. B. Infrarot- , Ultraviolett-Sichtbar-Spektroskopie , Phosphoreszenz usw., besteht darin, ein kleines transparentes Laborgefäß, eine Küvette , zu verwenden, um die zu analysierende Probe aufzunehmen.

Zur Durchführung einer Messung wird die Küvette mit der zu untersuchenden Flüssigkeit gefüllt und anschließend mit einem Laser beleuchtet, dessen Strahl durch eine der Küvettenflächen fokussiert wird. Eine Linse, die in einer Linie mit einer der Küvettenflächen und im 90°-Winkel zum Eintrittsfenster angeordnet ist, sammelt das laserinduzierte Fluoreszenzlicht. Nur ein kleines Volumen der Küvette wird tatsächlich vom Laser beleuchtet und erzeugt eine detektierbare spektroskopische Emission. Das Ausgangssignal ist deutlich reduziert, da die Linse aufgrund des Raumwinkels nur etwa 10 % der spektroskopischen Emission erfasst. Diese Technik wird seit mindestens 75 Jahren angewendet; sogar schon vor der Entwicklung des Lasers, als zur Anregung der Fluoreszenz noch konventionelle Lichtquellen verwendet wurden. ^{[ 5 ]}

SOFIA löst das Problem der geringen Sammelleistung, da es nahezu das gesamte Fluoreszenzlicht der zu analysierenden Probe sammelt und so die Menge des Fluoreszenzsignals im Vergleich zu herkömmlichen Geräten um etwa den Faktor 10 erhöht.

SOFIA ist ein Gerät und ein Verfahren zur Verbesserung der optischen Geometrie für die spektroskopische Detektion von Analyten in einer Probe. Die Erfindung hat ihre Funktionsfähigkeit bereits als Gerät und Verfahren zur ultrasensitiven Detektion von Prionen und anderen Analyten in niedrigen Konzentrationen unter Beweis gestellt. SOFIA kombiniert die Spezifität monoklonaler Antikörper zur Antigenbindung mit der Sensitivität der optischen Rundumdetektionstechnologie. Zur Detektion extrem niedriger Signalpegel dient eine rauscharme Photovoltaikdiode als Detektor. SOFIA nutzt einen Laser zur Beleuchtung eines die Probe enthaltenden Mikrokapillarröhrchens. Das von der Probe gesammelte Licht wird anschließend über optische Fasern in die Übertragungsoptik geleitet. Dort wird es optisch gefiltert und detektiert. Die Detektion erfolgt als Strommessung, die mittels eines Lock-in-Verstärkers gegen Rauschen verstärkt wird. Die Ergebnisse werden auf einem Computer mit entsprechender Datenerfassungssoftware angezeigt.

Die Vorteile eines solchen Detektionssystems sind vielfältig. Es ermöglicht vor allem die optimale Untersuchung kleinster Proben mit niedriger Konzentration mittels laserinduzierter Fluoreszenz. Dieses faserbasierte Detektionssystem ist mit bestehender Hardware für die Kurzpulsdetektion kompatibel , die ursprünglich für die Sequenzierung einzelner DNA-Moleküle entwickelt wurde. Die Geometrie eignet sich zudem für die Anwendung in Kurzpulslaser-Einzelmoleküldetektionsverfahren. Die Mehrport-Geometrie des Systems ermöglicht die effiziente elektronische Verarbeitung der Signale jedes Arms. Nicht zuletzt – und vielleicht am wichtigsten – weisen Glasfaserkabel eine nahezu 100%ige optische Übertragungseffizienz mit einer Dämpfung von weniger als 10 dB /km auf. Nach der Installation in einer Einrichtung können die Fluoreszenzdaten somit per Glasfaser an einen entfernten Ort übertragen und dort verarbeitet und analysiert werden.

SOFIA umfasst einen Probenbehälter mit mehreren Vertiefungen, eine automatische Vorrichtung zum sukzessiven Transport von Proben aus dem Probenbehälter mit mehreren Vertiefungen in eine transparente Kapillare innerhalb eines Probenhalters, eine Anregungsquelle in optischer Verbindung mit der Probe, wobei die Strahlung der Anregungsquelle entlang der Länge der Kapillare gerichtet ist und ein Signal induziert, das von der Probe emittiert wird, sowie mindestens eine lineare Anordnung.

Nach der Amplifikation und anschließenden Konzentrierung des Zielanalyten werden die Proben mithilfe eines Antikörpers zur Spezifität mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und schließlich in ein Mikrokapillarröhrchen gefüllt. Dieses Röhrchen befindet sich in einer speziell konstruierten Vorrichtung, sodass es vollständig von optischen Fasern umgeben ist, um das gesamte emittierte Licht nach Anregung des Farbstoffs mittels eines Lasers aufzufangen. ^{[ 6 ]}

Dieses Gerät ist ein spektroskopisches (lichtsammelndes) Gerät mit zugehörigem Verfahren zur schnellen Detektion und Analyse von Analyten in einer Probe. Die Probe wird mit einer Anregungsquelle bestrahlt, die in optischer Verbindung mit der Probe steht. Als Anregungsquelle kann beispielsweise ein Laser, eine Blitzlampe, eine Bogenlampe, eine Leuchtdiode oder Ähnliches verwendet werden.

Abbildung 1 zeigt die aktuelle Version des SOFIA-Systems. Vier lineare Anordnungen (101) erstrecken sich von einem Probenhalter (102), der einen länglichen, transparenten und beidseitig offenen Probenbehälter aufnimmt, zu einem Endanschluss (103). Das distale Ende des Endanschlusses (104) ist in eine Endanschlussbaugruppe (200) eingeführt. Die linearen Anordnungen (101) bestehen aus mehreren optischen Fasern mit jeweils einem ersten und einem zweiten Ende, die optional von einer Schutz- und/oder Isolierhülle umgeben sind. Die optischen Fasern sind linear angeordnet, d. h. sie liegen im Wesentlichen in einer Ebene und bilden so eine längliche Faserreihe.

Der zu untersuchende Analyt kann biologischer oder chemischer Natur sein und beispielsweise chemische Bestandteile (Toxine, Metaboliten, Arzneimittel und Arzneimittelrückstände), Peptide , Proteine, Zellbestandteile, Viren und Kombinationen davon umfassen. Der zu untersuchende Analyt kann in einer Flüssigkeit oder einem Trägermedium, wie beispielsweise einem Gel, vorliegen.

SOFIA hat sein Potenzial als Gerät mit einem breiten Anwendungsspektrum unter Beweis gestellt. Dazu gehören klinische Anwendungen wie die Erkennung von Krankheiten, die Aufdeckung von Prädispositionen für Pathologien, die Diagnosestellung und die Überwachung der Wirksamkeit verordneter Behandlungen sowie nichtklinische Anwendungen wie die Verhinderung des Eindringens von Toxinen und anderen Krankheitserregern in für den menschlichen Verzehr bestimmte Produkte:

• Klinische Anwendungen – SOFIA kann sowohl für qualitative Tests (positive oder negative Ergebnisse) zum Nachweis oder zur Identifizierung von Bakterien oder Viren als auch für quantitative Tests (Messung von Substanzen) zum Nachweis oder zur Quantifizierung biologischer Konstanten oder Marker verwendet werden. Dabei handelt es sich um Substanzen, die vom Körper beispielsweise bei einer Infektionskrankheit produziert werden (um die Viruslast, etwa in der AIDS-Therapie, oder den Grad der Toxizität bei Drogenmissbrauch zu bestimmen).
• Nichtklinische Anwendungen – Als Immunoassay kann SOFIA potenziell in größerem Umfang zur Überwachung der Qualität von Lebensmitteln, Arzneimitteln, Kosmetika oder Wasser sowie allgemeiner Umweltparameter und landwirtschaftlicher Produkte eingesetzt werden. Die Fähigkeit, Bakterien und Toxine in einer Vielzahl von Produkten nachzuweisen und zu untersuchen, ist eine zunehmend komplexe Anforderung, wie die steigende Häufigkeit von lebensmittel- und tierbedingten Erkrankungen wie E. coli, Salmonellen , BSE, Vogelgrippe usw. belegt.

SOFIA wird zur schnellen Detektion der abnormalen Form des Prionproteins ( PrP^{^Sc} ) in Körperflüssigkeiten wie Blut oder Urin eingesetzt. PrP^{^Sc} ist das Markerprotein in der Diagnostik transmissibler spongiformer Enzephalopathien (TSE), zu denen beispielsweise die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE ) bei Rindern (auch bekannt als „Rinderwahnsinn“), Scrapie bei Schafen und die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit beim Menschen zählen. Bislang existiert kein schnelles Verfahren zur Lebendbestimmung von PrP^{^Sc} in den geringen Konzentrationen, in denen es üblicherweise in Körperflüssigkeiten vorkommt. SOFIA bietet den Vorteil, dass nur eine geringe Probenvorbereitung erforderlich ist und die elektronischen Diagnosegeräte außerhalb des Sicherheitsbereichs platziert werden können.

TSEs, auch Prionenkrankheiten genannt, sind infektiöse neurodegenerative Erkrankungen von Säugetieren. Zu ihnen gehören die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE), die chronische Auszehrungskrankheit (CWD) bei Hirschen und Elchen, Scrapie bei Schafen und die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJK) beim Menschen. TSEs können durch die Aufnahme infizierten Gewebes oder durch Bluttransfusionen von Wirt zu Wirt übertragen werden. Klinische Symptome von TSEs sind Bewegungs- und Koordinationsstörungen sowie Demenz beim Menschen. Die Inkubationszeit beträgt Monate bis Jahre. Nach dem Auftreten klinischer Symptome schreiten die Erkrankungen jedoch rasch fort, sind nicht behandelbar und führen unweigerlich zum Tod. Bemühungen zur Risikominderung von TSEs haben zu erheblichen Veränderungen in der Produktion und im Handel mit Agrarprodukten, Arzneimitteln, Kosmetika, Blut- und Gewebespenden sowie biotechnologischen Produkten geführt. Die postmortale neuropathologische Untersuchung von Hirngewebe von Tieren oder Menschen gilt weiterhin als Goldstandard der TSE-Diagnostik und ist sehr spezifisch, jedoch nicht so sensitiv wie andere Methoden. ^{[ 7 ]}

Zur Verbesserung der Lebensmittelsicherheit wäre es vorteilhaft, alle Tiere mittels präklinischer Tests vor dem Auftreten von Symptomen auf Prionenerkrankungen zu untersuchen . Allerdings sind die PrP^{^Sc} -Werte bei präsymptomatischen Tieren sehr niedrig. Zudem ist PrP^{^Sc} im Körpergewebe ungleichmäßig verteilt, wobei die höchste Konzentration konstant im Nervensystem und sehr niedrige Konzentrationen in leicht zugänglichen Körperflüssigkeiten wie Blut oder Urin gefunden werden. Daher müsste ein solcher Test extrem geringe Mengen an PrP nachweisen und zwischen PrP^{^C} und PrP^{^Sc} unterscheiden .

Die derzeitigen Nachweismethoden für PrP^{^Sc} sind zeitaufwändig und erfordern eine postmortale Analyse, nachdem verdächtige Tiere ein oder mehrere Krankheitssymptome gezeigt haben. Die aktuellen Diagnoseverfahren basieren hauptsächlich auf dem Nachweis physikochemischer Unterschiede zwischen PrP^{^C} und PrP^{^Sc} , die bis dato die einzigen zuverlässigen Marker für TSEs darstellen. Beispielsweise nutzen die am weitesten verbreiteten Diagnosetests die relative Proteaseresistenz von PrP^{^Sc} in Hirnproben, um zwischen PrP^{^C} und PrP^{^Sc} zu unterscheiden , in Kombination mit dem antikörperbasierten Nachweis des PK -resistenten Anteils von PrP^{^Sc}. Prionenerkrankungen konnten bisher nicht mit konventionellen Methoden wie Polymerase-Kettenreaktion, Serologie oder Zellkulturassays nachgewiesen werden. Eine erregerspezifische Nukleinsäure wurde noch nicht identifiziert, und der infizierte Wirt bildet keine Antikörper.

Die konformationsveränderte Form von PrP^{^C} ist PrP^{^Sc} . Einige Forschungsgruppen vermuten, dass PrP^{^Sc} der Erreger (Prionenerreger) bei TSEs ist, andere nicht. PrP^{^Sc} könnte ein neuropathologisches Produkt des Krankheitsprozesses, eine Komponente des Erregers, der Erreger selbst oder etwas völlig anderes sein. Ungeachtet seiner genauen Funktion im Krankheitsgeschehen ist PrP^{^Sc} eindeutig spezifisch mit dem Krankheitsprozess assoziiert, und sein Nachweis deutet auf eine Infektion mit dem Erreger von Prionenerkrankungen hin.

SOFIA bietet unter anderem Methoden zur Diagnose von Prionenerkrankungen durch den Nachweis von PrP^{^Sc} in biologischen Proben. Als Proben können Hirngewebe, Nervengewebe, Blut, Urin, Lymphflüssigkeit , Liquor oder eine Kombination davon dienen. Das Fehlen von PrP^{^Sc} bedeutet, dass bis zur Nachweisgrenze der Methoden keine Infektion mit dem Erreger vorliegt. Der Nachweis von PrP^{^Sc} weist auf eine Infektion mit dem Erreger einer Prionenerkrankung hin. Eine Infektion mit dem Prionenerreger kann sowohl im präsymptomatischen als auch im symptomatischen Stadium der Erkrankung nachgewiesen werden.

Diese und weitere Verbesserungen wurden mit SOFIA erzielt. ^{[ 3 ]} Die Sensitivität und Spezifität von SOFIA macht eine PK-Verdauung zur Unterscheidung zwischen normalen und abnormalen PrP-Isoformen überflüssig. Der Nachweis von PrP^{^Sc} im Blutplasma wurde durch eine limitierte zyklische Amplifikation von Proteinfehlfaltungen (PMCA) gefolgt von SOFIA ermöglicht. Dank der hohen Sensitivität von SOFIA können die PMCA-Zyklen reduziert werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer spontanen PrP^{^Sc} -Bildung und falsch-positiver Ergebnisse sinkt. SOFIA erfüllt die Anforderungen an eine erhöhte Sensitivität beim Nachweis von Prionenerkrankungen sowohl bei präsymptomatischen als auch symptomatischen TSE-infizierten Tieren, einschließlich des Menschen. Dies wird durch Analysemethoden mit hochempfindlichen Instrumenten erreicht, die in Kombination mit neu entwickelten monoklonalen Antikörpern gegen PrP eine geringere Probenvorbereitung erfordern als bisher beschriebene Methoden. Die Methode der aktuellen SOFIA-Version bietet eine Sensitivität, die für den Nachweis von PrP^{^Sc} im Hirngewebe ausreicht. In Verbindung mit begrenzter sPMCA bieten die Verfahren der vorliegenden Erfindungen eine Empfindlichkeit, die ausreicht, um PrP ^Sc in Blutplasma, Gewebe und anderen Flüssigkeiten, die antemortem gesammelt wurden, nachzuweisen.

Die Methoden kombinieren die Spezifität monoklonaler Antikörper (mAbs) für die Antigenbindung und -konzentration mit der Sensitivität einer optischen Faseroptik-Detektionstechnologie. Im Gegensatz zu zuvor beschriebenen Methoden zum Nachweis von PrP^{^Sc} in Hirnhomogenaten verzichten diese Techniken bei der Untersuchung von Hirnhomogenaten auf die Verwendung von Impfstoff-Polymerisation, Amplifikation oder enzymatischer Verdauung (z. B. mit Proteinase K, kurz „PK“). Dies ist wichtig, da frühere Studien die Existenz von PrP^{^Sc} -Isoformen mit unterschiedlicher PK-Sensitivität beschrieben haben, was die Zuverlässigkeit des Assays beeinträchtigt. Die hohe Sensitivität dieses Assays macht ihn zu einer geeigneten Plattform für den schnellen Prionennachweis in biologischen Flüssigkeiten. Neben Prionenerkrankungen kann die Methode auch ein Mittel für schnelle Hochdurchsatztests für ein breites Spektrum von Infektionen und Erkrankungen bieten.

Während sich etwa 40 Zyklen sPMCA in Kombination mit Immunpräzipitation für den Nachweis von PrP^{^Sc} im Plasma mittels ELISA oder Western Blot als unzureichend erwiesen, konnte PrP^{^Sc} auch mittels SOFIA-Methoden problemlos gemessen werden. Die geringe Anzahl an Zyklen, die für die vorliegende Testplattform erforderlich ist, schließt die Möglichkeit falsch-positiver Ergebnisse im Zusammenhang mit PMCA, wie sie zuvor berichtet wurden (Thorne und Terry, 2008), praktisch aus. ^{[ 8 ]}

Dank rasanter Entwicklungen in der Biomarkerforschung lassen sich viele Infektionen und Erkrankungen, die bisher in vitro nicht diagnostizierbar waren, zunehmend diagnostizieren. Es wird erwartet, dass SOFIA in der Entwicklung diagnostischer Assays für Infektionen und Erkrankungen, die über Prionenerkrankungen hinausgehen, breitere Anwendung finden wird. ^{[ 3 ]} Ein wichtiges Anwendungsgebiet sind andere Proteinfehlfaltungserkrankungen, insbesondere Alzheimer. ^{[ 7 ]}

Eine Studie aus dem Jahr 2011 berichtete über den Nachweis von Prionen im Urin von natürlich und oral infizierten Schafen mit klinischem Scrapie-Erreger sowie von oral infizierten präklinischen und infizierten Weißwedelhirschen mit klinischer Chronic Wasting Disease (CWD). Dies ist der erste Bericht über den Nachweis von PrP^{^Sc-Prionen} im Urin von natürlich oder präklinisch prionenkranken Schafen oder Hirschen. ^{[ 1 ]}

Eine Studie aus dem Jahr 2010 zeigte, dass eine moderate Menge an Proteinfehlfaltungs-Cyclic-Amplification (PMCA) in Kombination mit einem neuartigen SOFIA-Nachweisverfahren zur Detektion von PrP^{^Sc} in protease-unbehandeltem Plasma von präklinischen und klinischen Scrapie-Schafen sowie von Weißwedelhirschen mit chronischer Auszehrungskrankheit nach natürlicher und experimenteller Infektion eingesetzt werden kann. Die krankheitsassoziierte Form des Prionproteins (PrP^{^Sc} ), die durch eine Konformationsänderung der normalen (zellulären) Form des Prionproteins (PrP^{^C} ) entsteht, gilt als zentral für die Neuropathogenese und dient als einziger zuverlässiger molekularer Marker für die Diagnose von Prionenerkrankungen. Obwohl die höchsten PrP^{^Sc} -Konzentrationen im ZNS vorliegen, erfordert die Entwicklung eines geeigneten diagnostischen Tests die Verwendung von Körperflüssigkeiten, die typischerweise extrem niedrige PrP^{^Sc} -Konzentrationen enthalten . PrP^{^Sc} wurde mittels PMCA-Technologie im Blut erkrankter Tiere nachgewiesen. Es wurde jedoch berichtet, dass wiederholte Zyklen über mehrere Tage, die für die PMCA von Blutproben notwendig sind, zu einer verringerten Spezifität (falsch-positive Ergebnisse) führen. Um einen hochsensitiven und -spezifischen Assay für PrP^{^Sc} im Blut zu entwickeln, verwendeten die Forscher eine limitierte serielle PMCA (sPMCA) mit SOFIA. Sie konnten keine Verbesserung der sPMCA durch die Zugabe von Polyadenylsäure feststellen, und es war auch nicht notwendig, die Genotypen der PrP^{^C-} und PrP^{^Sc} -Quellen für eine effiziente Amplifikation anzupassen. ^{[ 2 ]}

Eine Studie aus dem Jahr 2009 zeigte, dass SOFIA in seiner aktuellen Form weniger als 10 Attogramm (ag) rekombinantes PrP von Hamstern, Schafen und Hirschen nachweisen kann. Etwa 10 ag PrP^{^Sc} aus Gehirnen von mit 263K infizierten Hamstern lassen sich detektieren, wobei ähnliche Nachweisgrenzen für PrP^{^Sc} aus Gehirnen von Scrapie-infizierten Schafen und Hirschen mit chronischer Auszehrungskrankheit (CWD) gelten. Diese Nachweisgrenzen ermöglichen es, sowohl proteasebehandeltes als auch unbehandeltes Material so weit zu verdünnen, dass PrP^{^C} , unspezifische Proteine ​​oder andere Fremdstoffe die PrP^{^Sc} -Signaldetektion und/oder -spezifität nicht mehr beeinträchtigen können. Dadurch wird nicht nur das Problem der Spezifität der PrP^{^Sc} -Detektion gelöst, sondern auch die Sensitivität erhöht, da die Möglichkeit einer partiellen PrP^{^Sc} -Proteolyse kein Problem mehr darstellt. SOFIA wird voraussichtlich zu einer frühzeitigen Erkennung transmissibler Enzephalopathien vor dem Tod führen und ist zudem mit weiteren Zielamplifikationsprotokollen kompatibel. SOFIA stellt eine sensitive Methode zum Nachweis spezifischer Proteine ​​dar, die an der Pathogenese und/oder Diagnose von Krankheiten beteiligt sind und über den Bereich der transmissiblen spongiformen Enzephalopathien hinausgehen. ^{[ 3 ]}

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• Bionosis
• SOFIA Video-Einführung