Tandem-Massentag

In der analytischen Chemie ist ein Tandem-Massentag ( TMT ) ein chemisches Label, das die Multiplexierung von Proben in der massenspektrometrischen (MS) Quantifizierung und Identifizierung biologischer Makromoleküle wie Proteine , Peptide und Nukleinsäuren ermöglicht . TMT gehört zur Familie der isobaren Massentags , die aus Molekülen mit gleicher Masse bestehen, aber nach der Fragmentierung Reporterionen unterschiedlicher Masse erzeugen. Das relative Verhältnis der gemessenen Reporterionen repräsentiert die relative Häufigkeit des markierten Moleküls, wobei die Ionensuppression die Genauigkeit beeinträchtigt. ^{[ 1 ] [ 2 ]} Trotz dieser Komplikationen hat sich gezeigt, dass die TMT-basierte Proteomik eine höhere Präzision als die label-freie Quantifizierung ermöglicht . ^{[ 3 ]} Neben der Unterstützung der Proteinquantifizierung können TMT-Tags auch die Nachweisempfindlichkeit bestimmter stark hydrophiler Analyten, wie z. B. Phosphopeptide, in RPLC -MS-Analysen erhöhen. ^{[ 4 ]}

Derzeit sind sechs Varianten von TMT erhältlich: TMTzero, eine nicht-isotopisch substituierte Kernstruktur; TMTduplex, ein isobares Paar von Massenmarkierungen mit einer einzigen Isotopensubstitution; ^{[ 5 ]} TMTsixplex, ein isobares Set aus sechs Massenmarkierungen mit fünf Isotopensubstitutionen; ^{[ 6 ]} TMT 10-plex – ein Set aus 10 isotopischen Massenmarkierungen, die die Reporterregion von TMTsixplex verwenden, jedoch unterschiedliche Elementisotope, um eine Massendifferenz von 0,0063 Da zu erzeugen; ^{[ 7 ]} TMTpro, eine 16-plex-Version mit einem anderen Reporter und Massennormalisator als das ursprüngliche TMT; und TMTpro Zero.

Die Tags bestehen aus vier Regionen: einer Massenreporterregion (M), einer spaltbaren Linkerregion (F), einer Massennormalisierungsregion (N) und einer proteinreaktiven Gruppe (R). Die chemischen Strukturen aller Tags sind identisch, jedoch sind die Isotope an verschiedenen Positionen substituiert, sodass die Massenreporter- und Massennormalisierungsregionen in jedem Tag unterschiedliche Molekularmassen aufweisen . Die kombinierten MFNR-Regionen der Tags besitzen die gleiche Gesamtmolekularmasse und Struktur, sodass Moleküle, die mit unterschiedlichen Tags markiert sind, während der chromatographischen oder elektrophoretischen Trennung und im Einzel-MS-Modus nicht unterscheidbar sind. Bei der Fragmentierung im MS/MS- Modus werden Sequenzinformationen aus der Fragmentierung des Peptidrückgrats und gleichzeitig Quantifizierungsdaten aus der Fragmentierung der Tags gewonnen, wodurch Massenreporterionen entstehen.

Die Strukturen von TMT-Tags sind über die Unimod-Datenbank unter unimod.org öffentlich zugänglich, sodass Massenspektrometrie-Software wie Mascot die Tag-Massen berücksichtigen kann. Ab Version 2.2 ermöglicht Mascot zudem die Quantifizierung mit TMT und anderen isobaren Massentags ohne zusätzliche Software. Die Zuverlässigkeit einer Proteinmessung hängt intuitiv von der Ähnlichkeit der Verhältnisse verschiedener Peptide und der Signalstärke dieser Messungen ab. Ein mathematisch präziser Ansatz namens BACIQ, der Peptidintensitäten und die Übereinstimmung der Peptidmessungen in Konfidenzintervalle für Proteinverhältnisse integriert, hat sich etabliert. ^{[ 8 ]} Der TKO-Standard kann zur Beurteilung von Interferenzen herangezogen werden. ^{[ 9 ]}

TMT-Tags werden häufig verwendet, um Proben gleicher Häufigkeit zu markieren. Ist jedoch eine der markierten Proben häufiger vorhanden, kann dies die Sensitivität der Analyse für alle Proben erhöhen. ^{[ 10 ]} Solche isobar markierten Proben werden als isobare Träger bezeichnet. Sie wurden für die Einzelzell-Proteinanalyse mittels Massenspektrometrie eingeführt ^{[ 11 ]} und finden seither zahlreiche weitere Anwendungen. ^{[ 12 ]}