Ligase I, DNA, ATP-abhängig
Kennungen
SymbolLIG1
NCBI-Gen3978
HGNC6598
OMIM126391
RefSeqNM_000234
UniProtP18858
Andere Daten
OrtChr. 19 [1]
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Ligase III, DNA, ATP-abhängig
Kennungen
SymbolLIG3
NCBI-Gen3980
HGNC6600
OMIM600940
RefSeqNM_002311
UniProtP49916
Andere Daten
OrtChr. 17 q11.2-q12
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Die DNA-Ligase ist ein Enzym, das die Verknüpfung von DNA- Strängen durch die Katalyse der Bildung einer Phosphodiesterbindung ermöglicht . Sie spielt eine Rolle bei der Reparatur von Einzelstrangbrüchen in doppelsträngiger DNA in lebenden Organismen. Einige Formen (wie die DNA-Ligase IV ) können jedoch spezifisch Doppelstrangbrüche reparieren (d. h. Brüche in beiden komplementären DNA-Strängen). Einzelstrangbrüche werden von der DNA-Ligase mithilfe des komplementären Strangs der Doppelhelix als Matrize repariert [ 1 ]. Die DNA-Ligase knüpft dabei die abschließende Phosphodiesterbindung, um die DNA vollständig zu reparieren.

Die DNA-Ligase wird sowohl bei der DNA-Reparatur als auch bei der DNA-Replikation eingesetzt (siehe Säugetier-Ligasen ). Darüber hinaus findet die DNA-Ligase breite Anwendung in molekularbiologischen Laboren für rekombinante DNA- Experimente (siehe Forschungsanwendungen ). Gereinigte DNA-Ligase wird beim Klonen von Genen verwendet, um DNA-Moleküle zu rekombinanter DNA zu verknüpfen .

Enzymatischer Mechanismus

Die Abbildung veranschaulicht, wie die Ligase (gelbes Oval) zwei DNA-Fragmentstränge verknüpft. Die Ligase verbindet die beiden DNA-Fragmente zu einem längeren DNA-Strang, indem sie sie miteinander „verklebt“.

Der Mechanismus der DNA-Ligase besteht in der Bildung zweier kovalenter Phosphodiesterbindungen zwischen den 3'-Hydroxylenden eines Nukleotids („Akzeptor“) und dem 5'-Phosphatende eines anderen Nukleotids („Donor“). Für jede gebildete Phosphodiesterbindung werden zwei ATP-Moleküle verbraucht. [ 2 ] AMP ist für die Ligase-Reaktion erforderlich, die in vier Schritten abläuft:

  1. Reorganisation von Aktivitätsstellen wie z. B. Einzelstrangbrüchen in DNA-Abschnitten oder Okazaki-Fragmenten usw.
  2. Bei der Adenylylierung (Anlagerung von AMP) eines Lysinrests im aktiven Zentrum des Enzyms wird Pyrophosphat freigesetzt;
  3. Übertragung des AMP auf das 5'-Phosphat des sogenannten Donors, Bildung einer Pyrophosphatbindung;
  4. Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen dem 5'-Phosphat des Donors und dem 3'-Hydroxyl des Akzeptors. [ 3 ]
Ein bildliches Beispiel für die Funktionsweise einer Ligase (mit klebrigen Enden )

Ligase funktioniert auch mit stumpfen Enden , allerdings sind höhere Enzymkonzentrationen und andere Reaktionsbedingungen erforderlich.

Typen

E. coli

Die DNA-Ligase von E. coli wird durch das lig -Gen kodiert. Die DNA-Ligase in E. coli sowie in den meisten Prokaryoten nutzt die Energie, die durch die Spaltung von Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) freigesetzt wird, um die Phosphodiesterbindung zu knüpfen. [ 4 ] Sie kann DNA mit stumpfen Enden nur unter Bedingungen hoher Moleküldichte mit Polyethylenglykol ligieren und RNA nicht effizient mit DNA verknüpfen.

Die Aktivität der E. coli-DNA-Ligase kann durch DNA-Polymerase in geeigneten Konzentrationen gesteigert werden . Diese Steigerung ist jedoch nur dann möglich, wenn die Konzentrationen der DNA-Polymerase I deutlich niedriger sind als die der zu ligierenden DNA-Fragmente. Höhere Konzentrationen der Pol I-DNA-Polymerase wirken sich negativ auf die E. coli-DNA-Ligase aus [ 5 ].

T4

Die DNA-Ligase stammt vom Bakteriophagen T4 (einem Bakteriophagen , der Escherichia coli infiziert ). Die T4-Ligase ist die am häufigsten in der Laborforschung verwendete Ligase. [ 6 ] Sie kann sowohl kohäsive als auch stumpfe Enden von DNA, Oligonukleotiden sowie RNA und RNA-DNA-Hybriden ligieren, jedoch keine einzelsträngigen Nukleinsäuren. Sie kann stumpfe DNA-Enden deutlich effizienter ligieren als die E. coli -DNA-Ligase. Im Gegensatz zur E. coli -DNA-Ligase kann die T4-DNA-Ligase kein NAD verwenden und benötigt zwingend ATP als Cofaktor. Es wurden einige Optimierungsmaßnahmen durchgeführt, um die In-vitro- Aktivität der T4-DNA-Ligase zu verbessern. Ein erfolgreicher Ansatz testete beispielsweise die Fusion von T4-DNA-Ligase mit verschiedenen alternativen DNA-bindenden Proteinen. Dabei zeigte sich, dass die Konstrukte mit p50 oder NF-κB als Fusionspartner bei Blunt-End-Ligationen für Klonierungszwecke über 160 % aktiver waren als die Wildtyp-T4-DNA-Ligase. [ 7 ] Für eine typische Reaktion zum Einfügen eines Fragments in einen Plasmidvektor werden etwa 0,01 (klebrige Enden) bis 1 (blunte Enden) Einheiten Ligase benötigt. Die optimale Inkubationstemperatur für die T4-DNA-Ligase liegt bei 37 °C, der Temperatur, bei der die T4-Enzyme am aktivsten sind. Häufig werden Ligationsreaktionen jedoch bei 16 °C durchgeführt, einer optimalen Temperatur, bei der die Ligase sowohl aktiv ist als auch die Basenpaarung klebriger Enden ermöglicht.

Bakteriophagen-T4 -Ligase -Mutanten weisen eine erhöhte Empfindlichkeit sowohl gegenüber UV- Strahlung [ 8 ] [ 9 ] als auch gegenüber dem Alkylierungsmittel Methylmethansulfonat [ 10 ] auf , was darauf hindeutet, dass die DNA-Ligase bei der Reparatur der durch diese Substanzen verursachten DNA-Schäden eingesetzt wird .

Säugetier

Bei Säugetieren gibt es vier spezifische Ligasetypen.

  1. DNA-Ligase 1 : ligiert die neu synthetisierte DNA des Folgestrangs , nachdem die Ribonuklease H den RNA-Primer von den Okazaki-Fragmenten abgespalten hat .
  2. DNA-Ligase 3 : Sie bildet Komplexe mit dem DNA-Reparaturprotein XRCC1 und hilft so beim Verschließen der DNA während der Nukleotidexzisionsreparatur und beim Zusammenfügen rekombinanter Fragmente. Von allen bekannten DNA-Ligasen von Säugetieren wurde bisher nur Ligase 3 in den Mitochondrien nachgewiesen.
  3. Die DNA-Ligase 4 bildet Komplexe mit XRCC4 . Sie katalysiert den letzten Schritt der nicht-homologen Endverknüpfung (NEJ) zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen. Außerdem ist sie für die V(D)J-Rekombination erforderlich, den Prozess, der während der Entwicklung des Immunsystems die Diversität der Immunglobulin- und T-Zell-Rezeptor- Loci erzeugt .
  • DNA-Ligase 2: Ein Reinigungsartefakt, das durch proteolytischen Abbau der DNA-Ligase 3 entsteht. Ursprünglich wurde sie als eine weitere DNA-Ligase erkannt, was den Grund für die ungewöhnliche Nomenklatur der DNA-Ligasen darstellt. [ 11 ]

Die DNA-Ligase von Eukaryoten und einigen Mikroben verwendet Adenosintriphosphat (ATP) anstelle von NAD. [ 4 ]

Thermostabil

Das aus einem thermophilen Bakterium gewonnene Enzym ist stabil und bei deutlich höheren Temperaturen aktiv als herkömmliche DNA-Ligasen. Seine Halbwertszeit beträgt 48 Stunden bei 65 °C und mehr als eine Stunde bei 95 °C. Ampligase DNA-Ligase ist nachweislich mindestens 500 Temperaturzyklen (94 °C/80 °C) bzw. 16 Stunden aktiv.<sup> 10</sup>  Diese außergewöhnliche Thermostabilität ermöglicht eine extrem hohe Hybridisierungsspezifität und Ligationsspezifität.<sup> [ 12 ] </sup>

Aktivitätsmessung

Zur Messung der Aktivität der DNA-Ligase werden mindestens drei verschiedene Einheiten verwendet: [ 13 ]

  • Weiss-Einheit – die Menge an Ligase, die den Austausch von 1 nmol 32P von anorganischem Pyrophosphat gegen ATP in 20 Minuten bei 37 ° C katalysiert. Dies ist die am häufigsten verwendete Einheit.
  • Modrich-Lehman-Einheit - diese wird selten verwendet, und eine Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die erforderlich ist, um 100 nmol d(AT) n in 30 Minuten unter Standardbedingungen in eine Exonuklease-III-resistente Form umzuwandeln.
  • Viele kommerzielle Anbieter von Ligasen verwenden eine willkürliche Einheit, die auf der Fähigkeit der Ligase basiert, kohäsive Enden zu verknüpfen. Diese Einheiten sind oft eher subjektiv als quantitativ und ungenau.

Forschungsanwendungen

DNA-Ligasen sind in der modernen molekularbiologischen Forschung zu unverzichtbaren Werkzeugen für die Erzeugung rekombinanter DNA -Sequenzen geworden. Beispielsweise werden DNA-Ligasen zusammen mit Restriktionsenzymen verwendet , um DNA-Fragmente, häufig Gene , in Plasmide einzufügen .

Controlling the optimal temperature is a vital aspect of performing efficient recombination experiments involving the ligation of cohesive-ended fragments. Most experiments use T4 DNA Ligase (isolated from bacteriophage T4), which is most active at 37 °C.[14] However, for optimal ligation efficiency with cohesive-ended fragments ("sticky ends"), the optimal enzyme temperature needs to be balanced with the melting temperature Tm of the sticky ends being ligated,[15] the homologous pairing of the sticky ends will not be stable because the high temperature disrupts hydrogen bonding. A ligation reaction is most efficient when the sticky ends are already stably annealed, and disruption of the annealing ends would therefore result in low ligation efficiency. The shorter the overhang, the lower the Tm.

Since blunt-ended DNA fragments have no cohesive ends to anneal, the melting temperature is not a factor to consider within the normal temperature range of the ligation reaction. The limiting factor in blunt end ligation is not the activity of the ligase but rather the number of alignments between DNA fragment ends that occur. The most efficient ligation temperature for blunt-ended DNA would therefore be the temperature at which the greatest number of alignments can occur. The majority of blunt-ended ligations are carried out at 14-25 °C overnight. The absence of stably annealed ends also means that the ligation efficiency is lowered, requiring a higher ligase concentration to be used.[15]

A novel use of DNA ligase can be seen in the field of nano chemistry, specifically in DNA origami.  DNA based self-assembly principles have proven useful for organizing nanoscale objects, such as biomolecules, nanomachines, nanoelectronic and photonic component. Assembly of such nano structure requires the creation of an intricate mesh of DNA molecules. Although DNA self-assembly is possible without any outside help using different substrates such as provision of catatonic surface of Aluminium foil, DNA ligase can provide the enzymatic assistance that is required to make DNA lattice structure from DNA over hangs.[16]

History

Die erste DNA-Ligase wurde 1967 von den Laboren von Gellert, Lehman, Richardson und Hurwitz gereinigt und charakterisiert. [ 17 ] Weiss und Richardson führten die Reinigung und Charakterisierung erstmals mittels eines sechsstufigen chromatographischen Fraktionierungsverfahrens durch. Dieses begann mit der Entfernung von Zelltrümmern und der Zugabe von Streptomycin, gefolgt von mehreren Waschschritten an einer Diethylaminoethyl(DEAE)-Cellulose-Säule und einer abschließenden Phosphocellulose-Fraktionierung. Der finale Extrakt enthielt 10 % der ursprünglich in  E. coli-  Medium gemessenen Aktivität. Dabei wurde festgestellt, dass ATP und Mg²⁺ für die Optimierung der Reaktion notwendig sind. Die gängigen kommerziell erhältlichen DNA-Ligasen wurden ursprünglich in Bakteriophage T4 , E. coli und anderen Bakterien entdeckt . [ 18 ]

Störungen

Genetische Defekte der menschlichen DNA-Ligasen wurden mit klinischen Syndromen in Verbindung gebracht, die durch Immunschwäche, Strahlenempfindlichkeit und Entwicklungsstörungen gekennzeichnet sind  [ 17 ]. Das LIG4-Syndrom (Ligase-IV-Syndrom) ist eine seltene Erkrankung, die mit Mutationen in der DNA-Ligase 4 einhergeht und die Reparaturmechanismen von Doppelstrangbrüchen beeinträchtigt. Das Ligase-IV-Syndrom verursacht Immunschwäche und ist häufig mit Mikrozephalie und Knochenmarkhypoplasie assoziiert [ 19 ] . Eine Liste häufiger Erkrankungen, die durch einen Mangel oder eine Fehlfunktion der DNA-Ligase verursacht werden, folgt.

Xeroderma pigmentosum

Xeroderma pigmentosum , allgemein bekannt als XP, ist eine Erbkrankheit, die durch eine extreme Empfindlichkeit gegenüber ultravioletten (UV-)Strahlen des Sonnenlichts gekennzeichnet ist. Diese Erkrankung betrifft hauptsächlich die Augen und sonnenexponierte Hautpartien. Einige Betroffene weisen auch Probleme mit dem Nervensystem auf. [ 20 ]

Ataxie-Teleangiektasie

Mutationen im ATM-Gen verursachen  Ataxia teleangiectatica . Das ATM-Gen liefert die Bauanleitung für ein Protein, das die Zellteilung steuert und an der DNA-Reparatur beteiligt ist. Dieses Protein spielt eine wichtige Rolle in der normalen Entwicklung und Funktion verschiedener Körpersysteme, darunter des Nerven- und Immunsystems. Das ATM-Protein unterstützt Zellen bei der Erkennung beschädigter oder gebrochener DNA-Stränge und koordiniert die DNA-Reparatur, indem es Enzyme aktiviert, die die gebrochenen Stränge reparieren. Eine effiziente Reparatur beschädigter DNA-Stränge trägt zur Stabilität der genetischen Information der Zelle bei. Betroffene Kinder entwickeln typischerweise Schwierigkeiten beim Gehen, Probleme mit dem Gleichgewicht und der Handkoordination, unwillkürliche Zuckungen (Chorea), Muskelzuckungen (Myoklonus) und Nervenfunktionsstörungen (Neuropathie). Aufgrund der Bewegungsprobleme benötigen die Betroffenen in der Regel ab der Adoleszenz einen Rollstuhl. Menschen mit dieser Erkrankung sprechen außerdem undeutlich und haben Schwierigkeiten, die Augen seitlich zu bewegen (okulomotorische Apraxie). [ 21 ]

Fanconi-Anämie

Die Fanconi-Anämie (FA) ist eine seltene, vererbte Blutkrankheit, die zu Knochenmarkversagen führt. FA verhindert, dass das Knochenmark genügend neue Blutzellen für eine normale Körperfunktion produziert. Zudem kann FA dazu führen, dass das Knochenmark viele fehlerhafte Blutzellen bildet. Dies kann schwerwiegende Gesundheitsprobleme wie Leukämie zur Folge haben . [ 22 ]

Bloom-Syndrom

Das Bloom-Syndrom führt zu sonnenempfindlicher Haut und äußert sich meist durch einen schmetterlingsförmigen, geröteten Hautfleck auf Nase und Wangen. Auch an anderen sonnenexponierten Stellen wie Handrücken und Unterarmen kann ein Hautausschlag auftreten. Oftmals finden sich im Ausschlag kleine Ansammlungen erweiterter Blutgefäße (Teleangiektasien); diese können auch in den Augen vorkommen. Weitere Hautmerkmale sind hellere oder dunklere Hautpartien (Hypopigmentierung bzw. Hyperpigmentierung). Diese Flecken treten an nicht sonnenexponierten Hautstellen auf und stehen nicht im Zusammenhang mit dem Ausschlag.

Als Drogenziel

In jüngsten Studien wurde die humane DNA-Ligase I im computergestützten Wirkstoffdesign eingesetzt, um DNA-Ligase-Inhibitoren als mögliche Therapeutika zur Krebsbehandlung zu identifizieren. [ 23 ] Da übermäßiges Zellwachstum ein Kennzeichen der Krebsentstehung ist, kann eine gezielte Chemotherapie, die die Funktion der DNA-Ligase hemmt, das Fortschreiten von Krebserkrankungen verhindern. Darüber hinaus lassen sich DNA-Ligasen grob in zwei Kategorien einteilen: ATP- und NAD⁺ - abhängige. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass NAD⁺ - abhängige DNA-Ligasen zwar vereinzelt in zellulären oder viralen Nischen außerhalb des bakteriellen Bereichs entdeckt wurden, jedoch ist bisher keine NAD⁺ - abhängige Ligase in einem eukaryotischen Organismus nachgewiesen worden. Das ausschließliche Vorkommen in nicht-eukaryotischen Organismen, die einzigartige Substratspezifität und die besondere Domänenstruktur NAD⁺-abhängiger im Vergleich zu ATP-abhängigen humanen DNA-Ligasen machen NAD⁺ - abhängige Ligasen zu idealen Zielstrukturen für die Entwicklung neuer antibakterieller Wirkstoffe. [ 17 ]

Siehe auch

Referenzen

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