Ein Restriktionsenzym ( auch Restriktionsendonuklease , REase , ENase oder Restriktionase genannt) ist ein Enzym , das DNA an oder in der Nähe spezifischer Erkennungsstellen, den sogenannten Restriktionsstellen, in Fragmente spaltet . [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] Restriktionsenzyme sind eine Klasse der umfassenderen Gruppe der Endonukleasen . Sie werden üblicherweise in fünf Typen eingeteilt, die sich in ihrer Struktur und darin unterscheiden, ob sie ihr DNA- Substrat an der Erkennungsstelle schneiden oder ob Erkennungs- und Spaltstelle voneinander getrennt sind. Alle Restriktionsenzyme führen zum Schneiden der DNA zwei Einschnitte durch, jeweils einen durch jeden Zucker-Phosphat-Strang der DNA-Doppelhelix .

Diese Enzyme kommen in Bakterien und Archaeen vor und bilden einen Abwehrmechanismus gegen eindringende Viren . [ 4 ] [ 5 ] In einem Prokaryoten schneiden Restriktionsenzyme selektiv fremde DNA in einem Prozess, der als Restriktionsverdau bezeichnet wird ; gleichzeitig wird die Wirts-DNA durch ein Modifikationsenzym (eine Methyltransferase ) geschützt, das die prokaryotische DNA modifiziert und so die Spaltung verhindert. Zusammen bilden diese beiden Prozesse das Restriktions-Modifikationssystem . [ 6 ]

Es sind mehr als 3.600 Restriktionsendonukleasen bekannt, die über 250 verschiedene Spezifitäten aufweisen. [ 7 ] Über 3.000 davon wurden detailliert untersucht, und mehr als 800 sind kommerziell erhältlich. [ 8 ] Diese Enzyme werden routinemäßig zur DNA-Modifikation in Laboren eingesetzt und sind ein unverzichtbares Werkzeug beim molekularen Klonen . [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]

Geschichte

Unterschiedliche Restriktionsenzyme, die auf unterschiedliche Erkennungssequenzen wirken, erzeugen unterschiedliche DNA-Fragmente.

Der Begriff Restriktionsenzym stammt aus der Erforschung des Phagen λ , eines Bakterien infizierenden Virus , und des Phänomens der wirtsspezifischen Restriktion und Modifikation solcher bakterieller Phagen oder Bakteriophagen . [ 12 ] Dieses Phänomen wurde erstmals in den frühen 1950er Jahren in den Laboren von Salvador Luria , Jean Weigle und Giuseppe Bertani beschrieben. [ 13 ] [ 14 ] Es zeigte sich, dass die Ausbeute eines Bakteriophagen λ, der in einem Stamm von Escherichia coli , beispielsweise E. coli C, gut wächst, in einem anderen Stamm, beispielsweise E. coli K, um bis zu drei bis fünf Größenordnungen sinken kann. Die Wirtszelle, in diesem Beispiel E. coli K, wird als restriktiver Wirt bezeichnet und scheint die Fähigkeit zu besitzen, die biologische Aktivität des Phagen λ zu reduzieren. Etabliert sich ein Phage in einem Stamm, wird sein Wachstum auch in anderen Stämmen eingeschränkt. In den 1960er Jahren wurde in den Laboren von Werner Arber und Matthew Meselson gezeigt , dass die Restriktion durch eine enzymatische Spaltung der Phagen-DNA verursacht wird, und das beteiligte Enzym wurde daher als Restriktionsenzym bezeichnet. [ 4 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ]

Die von Arber und Meselson untersuchten Restriktionsenzyme waren Typ-I-Restriktionsenzyme, die DNA zufällig abseits der Erkennungssequenz spalten . [ 7 ] 1970 isolierten und charakterisierten Hamilton O. Smith , Thomas Kelly und Kent Wilcox das erste Typ-II-Restriktionsenzym , HindII, aus dem Bakterium Haemophilus influenzae . [ 18 ] [ 19 ] Restriktionsenzyme dieses Typs sind für Laborarbeiten besser geeignet, da sie DNA an der Stelle ihrer Erkennungssequenz spalten und am häufigsten als molekularbiologisches Werkzeug eingesetzt werden. [ 20 ] Später zeigten Daniel Nathans und Kathleen Danna, dass die Spaltung von SV40 -DNA durch Restriktionsenzyme spezifische Fragmente ergibt, die mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt werden können . Dies belegt, dass Restriktionsenzyme auch zur DNA-Kartierung verwendet werden können. [ 21 ] Für ihre Arbeiten zur Entdeckung und Charakterisierung von Restriktionsenzymen wurde Werner Arber , Daniel Nathans und Hamilton O. Smith 1978 der Nobelpreis für Physiologie oder Medizin verliehen . [ 22 ] Die Entdeckung von Restriktionsenzymen ermöglicht die Manipulation von DNA und führte zur Entwicklung der rekombinanten DNA -Technologie mit vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten, beispielsweise zur großtechnischen Herstellung von Proteinen wie dem von Diabetikern verwendeten Humaninsulin . [ 13 ] [ 23 ]

Ursprünge

Restriktionsenzyme entwickelten sich wahrscheinlich aus einem gemeinsamen Vorfahren und verbreiteten sich durch horizontalen Gentransfer . [ 24 ] [ 25 ] Zudem mehren sich die Hinweise darauf, dass Restriktionsendonukleasen sich als egoistisches genetisches Element entwickelten. [ 26 ]

Anerkennungsstätte

Eine palindromische Erkennungssequenz wird auf dem Rückwärtsstrang genauso gelesen wie auf dem Vorwärtsstrang, wenn beide in der gleichen Orientierung gelesen werden.

Restriktionsenzyme erkennen eine spezifische Nukleotidsequenz [ 2 ] und erzeugen einen Doppelstrangbruch in der DNA. Die Erkennungssequenzen lassen sich auch anhand der Anzahl der Basen in ihrer Erkennungssequenz klassifizieren, üblicherweise zwischen 4 und 8 Basen. Die Anzahl der Basen in der Sequenz bestimmt, wie häufig die Erkennungssequenz zufällig in einem Genom vorkommt. Beispielsweise würde eine Sequenz aus 4 Basenpaaren theoretisch alle 4⁴ bp (256 Basenpaare) auftreten, eine Sequenz aus 6 Basen alle 4⁶ bp (4.096 Basenpaare) und eine Sequenz aus 8 Basen alle 4⁸ bp (65.536 Basenpaare). [ 27 ] Viele dieser Sequenzen sind palindromisch , d. h. die Basensequenz ist vorwärts und rückwärts gelesen identisch. [ 28 ] Theoretisch sind zwei Arten von palindromischen Sequenzen in der DNA möglich. Das spiegelbildliche Palindrom ähnelt den in gewöhnlichen Texten vorkommenden Sequenzen, bei denen eine Sequenz auf einem einzelnen DNA-Strang vorwärts und rückwärts gleich ist, wie beispielsweise GTAATG. Das invertierte Wiederholungspalindrom ist ebenfalls eine Sequenz, die vorwärts und rückwärts gleich ist, jedoch befinden sich die Vorwärts- und Rückwärtssequenzen auf komplementären DNA-Strängen (d. h. doppelsträngiger DNA), wie beispielsweise GTATAC (GTATAC ist komplementär zu CATATG). [ 29 ] Invertierte Wiederholungspalindrome sind häufiger und von größerer biologischer Bedeutung als spiegelbildliche Palindrome.

Die EcoRI- Verdauung erzeugt "klebrige" Enden .

im Gegensatz dazu erzeugt die Spaltung durch das Restriktionsenzym SmaI „stumpfe“ Enden :

Die Erkennungssequenzen in der DNA unterscheiden sich für jedes Restriktionsenzym, was zu Unterschieden in der Länge, Sequenz und Strangorientierung ( 5'-Ende oder 3'-Ende ) eines klebrigen Endes („Überhang“) der Enzymrestriktion führt. [ 30 ]

Verschiedene Restriktionsenzyme, die dieselbe Sequenz erkennen, werden als Isoschizomere bezeichnet . Verschiedene Enzyme, die dieselbe Stelle erkennen, aber an einer anderen Position schneiden, werden als Neoschizomere bezeichnet . [ 31 ]

Typen

Natürlich vorkommende Restriktionsendonukleasen werden anhand ihrer Zusammensetzung und ihres Bedarfs an Enzym-Cofaktoren , der Art ihrer Zielsequenz und der Position ihrer DNA-Spaltstelle relativ zur Zielsequenz in fünf Gruppen (Typ I, II, III, IV und V) eingeteilt. [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ] DNA-Sequenzanalysen von Restriktionsenzymen zeigen jedoch große Variationen, was darauf hindeutet, dass es mehr als vier Typen gibt. [ 35 ] Alle Enzymtypen erkennen spezifische kurze DNA-Sequenzen und führen die endonukleolytische Spaltung der DNA durch, wodurch spezifische Fragmente mit terminalen 5'-Phosphaten entstehen. Sie unterscheiden sich in ihrer Erkennungssequenz, ihrer Untereinheitenzusammensetzung, ihrer Spaltposition und ihrem Bedarf an Cofaktoren, [ 36 ] [ 37 ] wie nachfolgend zusammengefasst:

  • Enzyme vom Typ I ( EC 3.1.21.3 ) spalten an Stellen, die von einer Erkennungsstelle entfernt liegen; benötigen sowohl ATP als auch S-Adenosyl-L-Methionin für ihre Funktion; multifunktionelles Protein mit Restriktionsverdau- und Methylase-Aktivität ( EC 2.1.1.72 ).
  • Typ-II-Enzyme ( EC 3.1.21.4 ) spalten innerhalb oder in kurzen spezifischen Abständen von einer Erkennungsstelle; die meisten benötigen Magnesium ; Einzelfunktionsenzyme (Restriktionsverdau) unabhängig von Methylasen.
  • Enzyme vom Typ III ( EC 3.1.21.5 ) spalten an Stellen, die sich in kurzem Abstand von einer Erkennungsstelle befinden; benötigen ATP (hydrolysieren es aber nicht); S-Adenosyl-L-Methionin stimuliert die Reaktion, ist aber nicht erforderlich; existieren als Teil eines Komplexes mit einer Modifikationsmethylase ( EC 2.1.1.72 ).
  • Enzyme des Typs IV zielen auf modifizierte DNA ab, z. B. methylierte, hydroxymethylierte und Glucosyl-hydroxymethylierte DNA.
  • Enzyme vom Typ V nutzen Leit-RNAs (gRNAs).

Typ l

Restriktionsenzyme vom Typ I wurden als erste identifiziert und zwar in zwei verschiedenen Stämmen (K-12 und B) von E. coli . [ 38 ] Diese Enzyme schneiden an einer Stelle, die sich von ihrer Erkennungssequenz unterscheidet und in zufälliger Entfernung (mindestens 1000 bp) liegt. Die Spaltung an diesen zufälligen Stellen erfolgt im Rahmen einer DNA-Translokation, was zeigt, dass diese Enzyme auch als molekulare Motoren fungieren. Die Erkennungssequenz ist asymmetrisch und besteht aus zwei spezifischen Abschnitten – einem mit 3–4 Nukleotiden und einem mit 4–5 Nukleotiden –, die durch einen unspezifischen Spacer von etwa 6–8 Nukleotiden getrennt sind. Diese Enzyme sind multifunktionell und können je nach Methylierungsstatus der Ziel-DNA sowohl Restriktionsverdau als auch Modifikationen durchführen. Die Cofaktoren S -Adenosylmethionin (AdoMet), hydrolysiertes Adenosintriphosphat ( ATP ) und Magnesiumionen (Mg²⁺ ) sind für ihre volle Aktivität erforderlich. Restriktionsenzyme vom Typ I bestehen aus drei Untereinheiten, HsdR, HsdM und HsdS. HsdR ist für den Restriktionsverdau erforderlich; HsdM ist für die Anlagerung von Methylgruppen an die Wirts-DNA (Methyltransferase-Aktivität) notwendig , und HsdS ist neben der Restriktionsverdauung (DNA-Spaltung) und der Modifikationsaktivität (DNA-Methyltransferase-Aktivität) wichtig für die Spezifität der Erkennungsstelle (DNA-Bindungsstelle). [ 32 ] [ 38 ]

Typ II

Typische Restriktionsenzyme vom Typ II unterscheiden sich in mehreren Punkten von Restriktionsenzymen vom Typ I. Sie bilden Homodimere mit Erkennungssequenzen, die üblicherweise ungeteilt, palindromisch und 4–8 Nukleotide lang sind. Sie erkennen und spalten DNA an derselben Stelle und benötigen für ihre Aktivität weder ATP noch AdoMet – in der Regel genügt Mg²⁺ als Cofaktor. [ 28 ] Diese Enzyme spalten die Phosphodiesterbindung der DNA-Doppelhelix. Die Spaltung kann entweder in der Mitte beider Stränge erfolgen und ein glattes Ende erzeugen oder versetzt, wodurch Überhänge, sogenannte klebrige Enden, entstehen. [ 40 ] Dies sind die am häufigsten verfügbaren und verwendeten Restriktionsenzyme. In den 1990er und frühen 2000er Jahren wurden neue Enzyme dieser Familie entdeckt, die nicht alle klassischen Kriterien dieser Enzymklasse erfüllten. Daraufhin wurde eine neue Subfamiliennomenklatur entwickelt , um diese große Familie anhand von Abweichungen von den typischen Eigenschaften von Typ-II-Enzymen in Unterkategorien zu unterteilen. [ 28 ] Diese Untergruppen werden durch einen Buchstabensuffix definiert.

Restriktionsenzyme vom Typ IIB (z. B. BcgI und BplI) sind Multimere und bestehen aus mehreren Untereinheiten. [ 28 ] Sie spalten die DNA beidseitig ihrer Erkennungssequenz, um diese herauszuschneiden. Sie benötigen die Cofaktoren AdoMet und Mg²⁺ . Restriktionsendonukleasen vom Typ IIE (z. B. NaeI) spalten die DNA nach Interaktion mit zwei Kopien ihrer Erkennungssequenz. [ 28 ] Eine Erkennungssequenz dient als Zielsequenz, während die andere als allosterischer Effektor die Spaltung beschleunigt oder effizienter gestaltet. Ähnlich wie Enzyme vom Typ IIE interagieren Restriktionsendonukleasen vom Typ IIF (z. B. NgoMIV) mit zwei Kopien ihrer Erkennungssequenz, spalten aber beide Sequenzen gleichzeitig. [ 28 ] Restriktionsendonukleasen vom Typ IIG (z. B. RM.Eco57I) besitzen wie klassische Restriktionsenzyme vom Typ II zwar nur eine Untereinheit, benötigen aber den Cofaktor AdoMet für ihre Aktivität. [ 28 ] Restriktionsendonukleasen vom Typ IIM, wie z. B. DpnI , können methylierte DNA erkennen und schneiden. [ 28 ] [ 41 ] [ 42 ] Restriktionsendonukleasen vom Typ IIS (z. B. FokI) spalten DNA in einem definierten Abstand von ihren nicht-palindromischen, asymmetrischen Erkennungssequenzen; [ 28 ] diese Eigenschaft wird häufig für In-vitro-Klonierungstechniken wie das Golden-Gate-Klonieren genutzt . Diese Enzyme können als Dimere fungieren . Auch Restriktionsenzyme vom Typ IIT (z. B. Bpu10I und BslI) bestehen aus zwei verschiedenen Untereinheiten. Einige erkennen palindromische Sequenzen, während andere asymmetrische Erkennungssequenzen besitzen. [ 28 ]

Typ III

Restriktionsenzyme vom Typ III (z. B. EcoP15) erkennen zwei separate, nicht-palindromische Sequenzen, die invers orientiert sind. Sie schneiden die DNA etwa 20–30 Basenpaare nach der Erkennungssequenz. [ 43 ] Diese Enzyme bestehen aus mehreren Untereinheiten und benötigen die Cofaktoren AdoMet und ATP für ihre Funktionen bei der DNA-Methylierung bzw. dem Restriktionsverdau . [ 44 ] Sie sind Bestandteile prokaryotischer DNA-Restriktions-Modifikationsmechanismen , die den Organismus vor eindringender fremder DNA schützen. Typ-III-Enzyme sind hetero-oligomere, multifunktionelle Proteine, die aus zwei Untereinheiten, Res ( P08764 ) und Mod ( P08763 ), bestehen. Die Mod-Untereinheit erkennt die für das System spezifische DNA-Sequenz und ist eine Modifikationsmethyltransferase ; als solche ist sie funktionell äquivalent zu den M- und S-Untereinheiten der Typ-I-Restriktionsendonuklease. Res ist für den Restriktionsverdau erforderlich, besitzt aber selbst keine enzymatische Aktivität. Typ-III-Enzyme erkennen kurze, 5–6 bp lange, asymmetrische DNA-Sequenzen und spalten diese 25–27 bp stromabwärts , wodurch kurze, einzelsträngige 5'-Überhänge entstehen. Für die Restriktionsverdauung benötigen sie zwei invers orientierte, unmethylierte Erkennungssequenzen. Diese Enzyme methylieren nur einen DNA-Strang an der N-6-Position der Adeninreste, sodass neu replizierte DNA nur einen methylierten Strang aufweist, was zum Schutz vor Restriktionsverdauung ausreicht. Typ-III-Enzyme gehören zur β-Unterfamilie der N6-Adenin-Methyltransferasen und enthalten die neun für diese Familie charakteristischen Motive , darunter Motiv I, die AdoMet- Bindungstasche (FXGXG), und Motiv IV, die katalytische Region (S/D/N (PP) Y/F). [ 36 ] [ 45 ]

Typ IV

Typ-IV-Enzyme erkennen modifizierte, typischerweise methylierte DNA und werden beispielsweise durch die McrBC- und Mrr-Systeme von  E. coli repräsentiert . [ 35 ]

Typ V

Restriktionsenzyme vom Typ V (z. B. der Cas9 -gRNA-Komplex aus CRISPR [ 46 ] ) nutzen Leit-RNAs , um spezifische, nicht-palindromische Sequenzen auf eindringenden Organismen zu erkennen. Sie können DNA variabler Länge schneiden, sofern eine geeignete Leit-RNA vorhanden ist. Die Flexibilität und einfache Anwendung dieser Enzyme machen sie vielversprechend für zukünftige Anwendungen in der Gentechnik . [ 46 ] [ 47 ]

Künstliche Restriktionsenzyme

Künstliche Restriktionsenzyme lassen sich durch Fusion einer natürlichen oder gentechnisch veränderten DNA-Bindungsdomäne mit einer Nukleasedomäne (häufig der Spaltungsdomäne des Typ-IIS-Restriktionsenzyms FokI ) erzeugen. [ 48 ] Solche künstlichen Restriktionsenzyme können große DNA-Abschnitte (bis zu 36 bp) erkennen und so konstruiert werden, dass sie an gewünschte DNA-Sequenzen binden. [ 49 ] Zinkfingernukleasen sind die am häufigsten verwendeten künstlichen Restriktionsenzyme und werden im Allgemeinen in gentechnischen Anwendungen eingesetzt, [ 50 ] [ 51 ] [ 52 ] [ 53 ] können aber auch für Standardanwendungen der Genklonierung verwendet werden . [ 54 ] Andere künstliche Restriktionsenzyme basieren auf der DNA-Bindungsdomäne von TAL-Effektoren . [ 55 ] [ 56 ]

Im Jahr 2013 wurde die neue Technologie CRISPR-Cas9 , basierend auf einem prokaryotischen viralen Abwehrsystem, zur Genomeditierung entwickelt und fand rasch Anwendung in Laboren. [ 57 ] Weitere Informationen finden Sie unter CRISPR (Clustered regular interspaced short palindromic repeats).

Im Jahr 2017 berichtete eine Gruppe der University of Illinois über die Verwendung eines aus Pyrococcus furiosus gewonnenen Argonaute -Proteins (PfAgo) zusammen mit einer Leit-DNA zur In-vitro -Editierung von DNA als künstliche Restriktionsenzyme. [ 58 ]

Es wurden auch künstliche Ribonukleasen entwickelt , die als Restriktionsenzyme für RNA fungieren. Ein PNA -basiertes System, PNAzym genannt, besitzt eine Cu(II) -2,9-Dimethylphenanthrolin- Gruppe, die Ribonukleasen für spezifische RNA-Sequenzen nachahmt und an einer nicht-basengepaarten Region (RNA-Ausbuchtung) der Ziel-RNA spaltet, die sich bei der Bindung des Enzyms an die RNA bildet. Dieses Enzym zeigt Selektivität, indem es nur an einer Stelle spaltet, die entweder keine Fehlpaarung aufweist oder kinetisch von zwei möglichen Spaltstellen bevorzugt ist. [ 59 ]

Nomenklatur

Herleitung des Namens EcoRI
Abkürzung Bedeutung Beschreibung
EEscherichiaGattung
cocolispezifische Arten
RRY13Beanspruchung
ICHZuerst identifiziertReihenfolge der Identifizierung im Bakterium

Seit ihrer Entdeckung in den 1970er Jahren wurden zahlreiche Restriktionsenzyme identifiziert; so wurden beispielsweise mehr als 3500 verschiedene Restriktionsenzyme vom Typ II charakterisiert. [ 60 ] Jedes Enzym wird nach dem Bakterium benannt , aus dem es isoliert wurde. Die Benennung basiert auf Gattung , Art und Stamm des Bakteriums . [ 61 ] [ 62 ] Der Name des Restriktionsenzyms EcoRI leitet sich beispielsweise wie im Kasten dargestellt ab.

Anwendungen

Isolierte Restriktionsenzyme werden zur Manipulation von DNA für verschiedene wissenschaftliche Anwendungen eingesetzt.

Sie dienen der Unterstützung des Einfügens von Genen in Plasmidvektoren bei Genklonierungs- und Proteinproduktionsexperimenten . Für eine optimale Nutzung werden die üblicherweise für die Genklonierung verwendeten Plasmide so modifiziert, dass sie eine kurze Polylinkersequenz (die sogenannte multiple Klonierungsstelle , MCS) mit vielen Restriktionserkennungssequenzen enthalten . Dies ermöglicht Flexibilität beim Einfügen von Genfragmenten in den Plasmidvektor. Die natürlich in Genen vorhandenen Restriktionsstellen beeinflussen die Wahl der Endonuklease für den DNA-Verdau, da beim gezielten Schneiden der DNA-Enden eine Restriktion der gewünschten DNA vermieden werden muss. Um ein Genfragment in einen Vektor zu klonieren, werden sowohl die Plasmid-DNA als auch das Geninsert typischerweise mit denselben Restriktionsenzymen geschnitten und anschließend mithilfe einer DNA-Ligase miteinander verbunden . [ 63 ] [ 64 ]

Restriktionsenzyme können auch zur Unterscheidung von Genallelen eingesetzt werden, indem sie spezifisch Einzelbasenveränderungen in der DNA, sogenannte Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), erkennen. [ 65 ] [ 66 ] Dies ist jedoch nur möglich, wenn ein SNP die Restriktionsstelle im Allel verändert. Mit dieser Methode kann das Restriktionsenzym zur Genotypisierung einer DNA-Probe verwendet werden, ohne dass eine aufwendige Gensequenzierung erforderlich ist . Die Probe wird zunächst mit dem Restriktionsenzym verdaut, um DNA-Fragmente zu erzeugen. Anschließend werden die unterschiedlich großen Fragmente mittels Gelelektrophorese getrennt . Im Allgemeinen erzeugen Allele mit korrekten Restriktionsstellen zwei sichtbare DNA-Banden im Gel, während Allele mit veränderten Restriktionsstellen nicht geschnitten werden und nur eine einzige Bande erzeugen. Durch Restriktionsverdau kann auch eine DNA-Karte erstellt werden, die die relative Position der Gene angibt . [ 67 ] Die durch Restriktionsverdau erzeugten DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge ergeben nach der Gelelektrophorese ein spezifisches Bandenmuster und können für den genetischen Fingerabdruck verwendet werden .

In ähnlicher Weise werden Restriktionsenzyme verwendet, um genomische DNA für die Genanalyse mittels Southern Blot zu verdauen . Diese Technik ermöglicht es Forschern, die Anzahl der Kopien (oder Paraloge ) eines Gens im Genom eines Individuums oder die Anzahl der Genmutationen ( Polymorphismen ) innerhalb einer Population zu bestimmen. Letzteres wird als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) bezeichnet. [ 68 ]

Künstliche Restriktionsenzyme, die durch Verknüpfung der FokI-DNA-Spaltungsdomäne mit einer Reihe von DNA-bindenden Proteinen oder Zinkfinger-Arrays entstehen und als Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) bezeichnet werden, sind aufgrund ihrer erhöhten Sequenzspezifität ein leistungsstarkes Werkzeug für die Genomeditierung. ZFN arbeiten paarweise, wobei ihre Dimerisierung in situ durch die FokI-Domäne vermittelt wird. Jedes Zinkfinger-Array ( ZFA ) kann 9–12 Basenpaare erkennen, sodass das Paar insgesamt 18–24 Basenpaare umfasst. Ein 5–7 bp langer Spacer zwischen den Spaltstellen erhöht die Spezifität der ZFN zusätzlich und macht sie zu einem sicheren und präzisen Werkzeug, das auch beim Menschen angewendet werden kann. Kürzlich wurde eine klinische Phase-I-Studie mit ZFN zur gezielten Ausschaltung des CCR5-Korezeptors für HIV-1 durchgeführt. [ 69 ]

Andere schlugen vor, das bakterielle RM-System als Modell für die Entwicklung antiviraler Gen- oder Genomimpfstoffe und Therapien beim Menschen zu nutzen, da das RM-System in Bakterien eine angeborene Abwehrfunktion erfüllt, indem es den Tropismus von Bakteriophagen einschränkt . [ 70 ] Es gibt Forschungen zu Restriktionsenzymen (REasen) und Zinkfingerproteinen (ZFN), die die DNA verschiedener humaner Viren, darunter HSV-2 , Hochrisiko- HPV und HIV-1, spalten können, mit dem Ziel, gezielte Mutationen und Aberrationen humanpathogener Viren hervorzurufen. [ 71 ] [ 72 ] [ 73 ] Das menschliche Genom enthält bereits Überreste von inaktivierten Retrovirusgenomen , die für den eigenen Vorteil genutzt wurden. Tatsächlich scheinen die Mechanismen zur Stilllegung aktiver L1-Genom-Retroelemente durch die Three-Prime-Reparatur-Exonuklease 1 ( TREX1 ) und das Exzisionsreparatur-Kreuzkomplementierungsprotein 1 (ERCC) die Wirkung von RM-Systemen in Bakterien sowie die nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) nachzuahmen , die auf die Verwendung von ZFN ohne Reparaturvorlage folgt. [ 74 ] [ 75 ]

Beispiele

Beispiele für Restriktionsenzyme sind: [ 76 ]

EnzymQuelleErkennungssequenzSchneiden
EcoRIEscherichia coli
5'GAATTC 3'CTTAAG 
5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5'
EcoRIIEscherichia coli
5'CCWGG 3'GGWCC 
5'--- CCWGG---3' 3'---GGWCC ---5'
BamHIBacillus amyloliquefaciens
5'GGATCC 3'CCTAGG 
5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5'
HindIIIHaemophilus influenzae
5'AAGCTT 3'TTCGAA 
5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5'
TaqIThermus aquaticus
5'TCGA 3'AGCT 
5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5'
NotINocardia otitidis
5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG 
5'---GC GGCCGC---3' 3'---CGCCGG CG---5'
HinFIHaemophilus influenzae
5'GANTC 3'CTNAG 
5'---G ANTC---3' 3'---CTNA G---5'
Sau3AIStaphylococcus aureus
5'GATC 3'CTAG 
5'--- GATC---3' 3'---CTAG ---5'
PvuII*Proteus vulgaris
5'CAGCTG 3'GTCGAC 
5'---CAG CTG---3' 3'---GTC GAC---5'
Klein*Serratia marcescens
5'CCCGGG 3'GGGCCC 
5'---CCC GGG---3' 3'---GGG CCC---5'
HaeIII*Haemophilus aegyptius
5'GGCC 3'CCGG 
5'---GG CC---3' 3'---CC GG---5'
HgaI [ 77 ]Haemophilus gallinarum
5'GACGC 3'CTGCG 
5'---NN NN---3' 3'---NN NN---5'
AluI*Arthrobacter luteus
5'AGCT 3'TCGA 
5'---AG CT---3' 3'---TC GA---5'
EcoRV*Escherichia coli
5'GATATC 3'CTATAG 
5'---GAT ATC---3' 3'---CTA TAG---5'
EcoP15IEscherichia coli
5'CAGCAGN 25 NN 3'GTCGTCN 25 NN 
5'---CAGCAGN 25 NN---3' 3'---GTCGTCN 25 NN ---5'
KpnI [ 78 ]Klebsiella pneumoniae
5'GGTACC 3'CCATGG 
5'---GGTAC C---3' 3'---C CATGG---5'
PstI [ 78 ]Providencia stuartii
5'CTGCAG 3'GACGTC 
5'---CTGCA G---3' 3'---G ACGTC---5'
SacI [ 78 ]Streptomyces achromogenes
5'GAGCTC 3'CTCGAG 
5'---GAGCT C---3' 3'---C TCGAG---5'
SalI [ 78 ]Streptomyces albus
5'GTCGAC 3'CAGCTG 
5'---G TCGAC---3' 3'---CAGCT G---5'
ScaI* [ 78 ]Streptomyces caespitosus
5'AGTACT 3'TCATGA 
5'---AGT ACT---3' 3'---TCA TGA---5'
SpeISphaerotilus natans
5'ACTAGT 3'TGATCA 
5'---A CTAGT---3' 3'---TGATC A---5'
SphI [ 78 ]Streptomyces phaeochromogenes
5'GCATGC 3'CGTACG 
5'---GCATG C---3' 3'---C GTACG---5'
StuI* [ 79 ] [ 80 ]Streptomyces tubercidicus
5'AGGCCT 3'TCCGGA 
5'---AGG CCT---3' 3'---TCC GGA---5'
XbaI [ 78 ]Xanthomonas badrii
5'TCTAGA 3'AGATCT 
5'---T CTAGA---3' 3'---AGATC T---5'

Legende: * = stumpfe Enden N = C oder G oder T oder A W = A oder T

Siehe auch

Referenzen

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