Elektrospray-Ionisationsquelle (NanoSpray)

Die Elektrospray-Ionisation ( ESI ) ist eine Technik der Massenspektrometrie zur Ionenerzeugung mittels Elektrospray. Dabei wird eine Hochspannung an eine Flüssigkeit angelegt, um ein Aerosol zu erzeugen . Sie eignet sich besonders gut zur Ionenerzeugung aus Makromolekülen , da sie deren Fragmentierungsneigung bei der Ionisation überwindet. ESI unterscheidet sich von anderen Ionisationsverfahren (z. B. Matrix-unterstützter Laserdesorption/Ionisation , MALDI), da sie mehrfach geladene Ionen erzeugen kann. Dadurch wird der Massenbereich des Analysators erweitert und deckt nun den kDa-MDa- Bereich ab, der bei Proteinen und ihren assoziierten Polypeptidfragmenten vorkommt. [ 1 ] [ 2 ]

Die Massenspektrometrie mit ESI wird als Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) oder, seltener, als Elektrospray-Massenspektrometrie (ES-MS) bezeichnet. ESI ist eine sogenannte „weiche“ Ionisationstechnik, da nur sehr geringe Fragmentierung auftritt. Dies kann insofern vorteilhaft sein, als das Molekülion (oder genauer ein Pseudo-Molekülion) fast immer beobachtet wird. Allerdings lassen sich aus dem einfachen Massenspektrum nur wenige Strukturinformationen gewinnen. Dieser Nachteil kann durch die Kopplung von ESI mit Tandem-Massenspektrometrie (ESI-MS/MS) überwunden werden. Ein weiterer wichtiger Vorteil von ESI ist, dass Informationen aus der Lösungsphase in die Gasphase übertragen werden können.

Die Elektrospray-Ionisationstechnik wurde erstmals 1984 von Masamichi Yamashita und John Fenn beschrieben [ 3 ] und unabhängig davon ebenfalls 1984 von Lidia Gall und Mitarbeitern in der Sowjetunion [ 4 ]. Galls Arbeit fand in der westlichen Fachliteratur erst 2008 Anerkennung und wurde in einer Übersetzung veröffentlicht [ 4 ]. Die Entwicklung der Elektrospray-Ionisation zur Analyse biologischer Makromoleküle [ 5 ] wurde 2002 mit der Verleihung des Nobelpreises für Chemie an John Bennett Fenn und Koichi Tanaka gewürdigt [ 6 ]. Eines der von Fenn verwendeten Originalgeräte ist im Science History Institute in Philadelphia, Pennsylvania, ausgestellt.

Geschichte

Schema der Elektrospray-Ionisation im positiven Modus: Unter Hochspannung emittiert der Taylor-Kegel einen Strahl von Flüssigkeitströpfchen. Das Lösungsmittel verdunstet nach und nach aus den Tröpfchen, wodurch diese zunehmend geladen werden. Sobald die Ladung die Rayleigh-Grenze überschreitet, dissoziiert das Tröpfchen explosionsartig und hinterlässt einen Strom geladener (positiver) Ionen.

Im Jahr 1882 schätzte Lord Rayleigh theoretisch die maximale Ladungsmenge ab, die ein Flüssigkeitstropfen tragen kann, bevor er feine Flüssigkeitsstrahlen ausstößt. [ 7 ] Dies ist heute als Rayleigh-Grenze bekannt.

1914 veröffentlichte John Zeleny eine Arbeit über das Verhalten von Flüssigkeitströpfchen am Ende von Glaskapillaren und präsentierte Belege für verschiedene Elektrospray-Modi. [ 8 ] Wilson und Taylor [ 9 ] sowie Nolan untersuchten Elektrospray in den 1920er Jahren [ 10 ] und Macky im Jahr 1931. [ 11 ] Der Elektrospray-Kegel (heute bekannt als Taylor-Kegel ) wurde von Sir Geoffrey Ingram Taylor beschrieben . [ 12 ]

Die erste Anwendung der Elektrospray-Ionisation in der Massenspektrometrie wurde 1968 von Malcolm Dole beschrieben. [ 13 ] [ 14 ] John Bennett Fenn erhielt 2002 den Nobelpreis für Chemie für die Entwicklung der Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie in den späten 1980er Jahren. [ 15 ]

Ionisationsmechanismus

Fenns erste Elektrospray-Ionisationsquelle, die an ein einzelnes Quadrupol-Massenspektrometer gekoppelt ist

Die die Analyten enthaltende Flüssigkeit (typischerweise 10⁻⁶ bis 10⁻⁴ M erforderlich [ 16 ] ) wird mittels Elektrospray [ 17 ] in ein feines Aerosol zerstäubt . Da die Ionenbildung eine intensive Lösungsmittelverdampfung (auch Desolvatisierung genannt) beinhaltet, werden die typischen Lösungsmittel für die Elektrospray-Ionisation durch Mischen von Wasser mit flüchtigen organischen Verbindungen (z. B. Methanol [ 18 ] , Acetonitril ) hergestellt. Um die anfängliche Tröpfchengröße zu verringern, werden üblicherweise Verbindungen zur Erhöhung der Leitfähigkeit (z. B. Essigsäure ) zugesetzt. Diese Substanzen dienen auch als Protonenquelle und erleichtern so den Ionisationsprozess. Elektrosprays mit hohem Durchfluss können zusätzlich zur hohen Temperatur der ESI-Quelle durch die Vernebelung eines erhitzten Inertgases wie Stickstoff oder Kohlendioxid optimiert werden. [ 19 ] Das Aerosol wird über eine Kapillare, die eine Potentialdifferenz von ca. 3000 V aufweist, in die erste Vakuumstufe eines Massenspektrometers geleitet. Die Kapillare kann erhitzt werden, um die weitere Verdunstung des Lösungsmittels aus den geladenen Tröpfchen zu fördern. Das Lösungsmittel verdunstet aus einem geladenen Tröpfchen, bis dieses beim Erreichen seiner Rayleigh-Grenze instabil wird. An diesem Punkt deformiert sich das Tröpfchen, da die elektrostatische Abstoßung gleichnamiger Ladungen in einem immer kleiner werdenden Tröpfchen stärker wird als die Oberflächenspannung, die das Tröpfchen zusammenhält. [ 20 ] Nun unterliegt das Tröpfchen der Coulomb-Spaltung, wobei das ursprüngliche Tröpfchen „explodiert“ und viele kleinere, stabilere Tröpfchen entstehen. Die neuen Tröpfchen desolvatisieren und spalten sich anschließend erneut per Coulomb-Spaltung. Während der Spaltung verliert das Tröpfchen einen geringen Anteil seiner Masse (1,0–2,3 %) sowie einen relativ großen Anteil seiner Ladung (10–18 %). [ 21 ] [ 22 ] 

Es gibt zwei Haupttheorien zur Erklärung der finalen Bildung von Ionen in der Gasphase: das Ionenverdampfungsmodell (IEM) und das Ladungsrestmodell (CRM). Das IEM besagt, dass die Feldstärke an der Oberfläche des Tröpfchens ab einem bestimmten Radius so groß wird, dass sie die Feld-Desorption solvatisierter Ionen unterstützt. [ 23 ] [ 24 ] Das CRM geht davon aus, dass Elektrospray-Tröpfchen Verdampfungs- und Spaltungszyklen durchlaufen, wodurch schließlich Tochtertröpfchen entstehen, die im Durchschnitt ein Analyt- Ion oder weniger enthalten. [ 13 ] Die Ionen in der Gasphase bilden sich, nachdem die restlichen Lösungsmittelmoleküle verdampft sind und das Analyt-Ion die Ladungen des Tröpfchens trägt.

IEM-, CRM- und CEM-Schaltplan.

Zahlreiche Belege zeigen direkt oder indirekt, dass kleine Ionen (aus kleinen Molekülen ) durch Ionenverdampfung in die Gasphase freigesetzt werden [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ] , während größere Ionen (beispielsweise aus gefalteten Proteinen) durch geladene Reste gebildet werden [ 27 ] [ 28 ] [ 29 ] .

Es wurde ein drittes Modell vorgeschlagen, das die kombinierte Emission geladener Reste einbezieht. [ 30 ] Ein weiteres Modell, das sogenannte Kettenauswurfmodell (CEM), wird für ungeordnete Polymere (entfaltete Proteine) vorgeschlagen. [ 31 ]

Die massenspektrometrisch beobachteten Ionen können quasimolekulare Ionen sein, die durch Addition eines Wasserstoffkations ([ M  + H] ⁺ ) oder eines anderen Kations wie beispielsweise eines Natriumions ([ M  + Na] ⁺ ) oder durch Abspaltung eines Wasserstoffkerns ([ M  − H] ⁻) entstehen . Mehrfach geladene Ionen wie [ M  +  nH ] ⁿ⁺ werden häufig beobachtet. Bei großen Makromolekülen können mehrere Ladungszustände auftreten, was zu einer charakteristischen Ladungszustandshüllkurve führt. Es handelt sich dabei ausschließlich um Ionen mit gerader Elektronenzahl: Im Gegensatz zu manchen anderen Ionisationsquellen werden keine Elektronen (allein) hinzugefügt oder entfernt. Die Analyten können an elektrochemischen Prozessen beteiligt sein , die zu Verschiebungen der entsprechenden Peaks im Massenspektrum führen . Dieser Effekt wird bei der direkten Ionisation von Edelmetallen wie Kupfer, Silber und Gold mittels Elektrospray demonstriert. [ 32 ]

Die Effizienz der Erzeugung von Gasphasenionen für kleine Moleküle mittels ESI variiert in Abhängigkeit von der Verbindungsstruktur, dem verwendeten Lösungsmittel und den Geräteparametern. [ 33 ] Die Unterschiede in der Ionisierungseffizienz betragen mehr als eine Million Mal.

Varianten

Elektrosprays, die mit niedrigen Flussraten betrieben werden, erzeugen deutlich kleinere Anfangströpfchen, was eine verbesserte Ionisierungseffizienz gewährleistet . 1993 berichteten Gale und Richard D. Smith , dass sich mit noch niedrigeren Flussraten bis hinunter zu 200 nL/min signifikante Empfindlichkeitssteigerungen erzielen lassen. [ 34 ] 1994 prägten zwei Forschungsgruppen die Bezeichnung Mikroelektrospray (Mikrospray) für Elektrosprays, die mit niedrigen Flussraten arbeiten. Emmett und Caprioli demonstrierten eine verbesserte Leistung für HPLC-MS-Analysen, wenn der Elektrospray mit 300–800 nL/min betrieben wurde. [ 35 ] Wilm und Mann zeigten, dass ein Kapillarfluss von ~25 nL/min einen Elektrospray an der Spitze von Emitter aufrechterhalten kann, die durch Ziehen von Glaskapillaren auf wenige Mikrometer hergestellt wurden. [ 36 ] Letzteres wurde 1996 in Nano-Elektrospray (Nanospray) umbenannt. [ 37 ] [ 38 ] Derzeit wird die Bezeichnung Nanospray auch für Elektrosprays verwendet, die mit Pumpen bei niedrigen Flussraten gespeist werden, [ 39 ] nicht nur für selbstversorgende Elektrosprays. Obwohl es möglicherweise keinen klar definierten Flussratenbereich für Elektrospray, Mikrospray und Nano-Elektrospray gibt, untersuchten [ 40 ] „Änderungen der Analytverteilung während der Tröpfchenspaltung vor der Ionenfreisetzung“. [ 40 ] In dieser Arbeit vergleichen sie die Ergebnisse dreier anderer Gruppen. [ 41 ] [ 42 ] [ 43 ] Anschließend messen sie das Signalintensitätsverhältnis [Ba 2+ + Ba + ]/[BaBr + ] bei verschiedenen Flussraten.

Die Kaltspray-Ionisation ist eine Form der Elektrospray-Ionisation, bei der die Probenlösung durch eine kleine, kalte Kapillare (10–80 °C) in ein elektrisches Feld gepresst wird , um einen feinen Nebel aus kalten, geladenen Tröpfchen zu erzeugen. [ 44 ] Zu den Anwendungsgebieten dieser Methode gehören die Analyse empfindlicher Moleküle und Wirt-Gast-Wechselwirkungen, die mit herkömmlicher Elektrospray-Ionisation nicht untersucht werden können.

Die Elektrospray-Ionisation wurde auch bei Drücken bis hinunter zu 25 Torr erreicht und als Subambient-Druck-Ionisation mit Nanoelektrospray (SPIN) bezeichnet. Sie basiert auf einer zweistufigen Ionentrichterschnittstelle, die von Richard D. Smith und Mitarbeitern entwickelt wurde. [ 45 ] Die SPIN-Implementierung ermöglichte eine erhöhte Empfindlichkeit durch die Verwendung von Ionentrichtern, die die Ionen einschlossen und in den Niederdruckbereich des Massenspektrometers transportierten. Der Nanoelektrospray-Emitter besteht aus einer feinen Kapillare mit einer kleinen Öffnung von etwa 1–3 Mikrometern. Für eine ausreichende Leitfähigkeit wird diese Kapillare üblicherweise mit einem leitfähigen Material, z. B. Gold, bedampft. Die Nanoelektrospray-Ionisation benötigt nur wenige Mikroliter Probe und erzeugt kleinere Tröpfchen. [ 46 ] Der Betrieb bei niedrigem Druck war besonders effektiv bei geringen Flussraten, da die kleinere Größe der Elektrospray-Tröpfchen eine effektive Desolvatisierung und Ionenbildung ermöglichte. Infolgedessen konnten die Forscher später nachweisen, dass eine Gesamtionisierungsausnutzung von über 50 % beim Transfer von Ionen aus der flüssigen Phase in die Gasphase als Ionen und durch die Dual-Ionen-Funnel-Schnittstelle zum Massenspektrometer erreicht wurde. [ 47 ]

Umgebungsionisierung

Diagramm einer DESI-Umgebungsionisationsquelle

Bei der Ambient-Ionisation erfolgt die Ionenbildung außerhalb des Massenspektrometers ohne Probenvorbereitung. [ 48 ] [ 49 ] [ 50 ] In einer Reihe von Ambient-Ionenquellen wird die Ionenbildung mittels Elektrospray-Ionisation (ESI) durchgeführt.

Die Desorptions-Elektrospray-Ionisation (DESI) ist eine Ionisationstechnik unter Umgebungsbedingungen, bei der ein Lösungsmittel-Elektrospray auf eine Probe gerichtet wird. [ 51 ] [ 52 ] Durch Anlegen einer Spannung an die Probe wird der Elektrospray an die Oberfläche gezogen. Die Probenbestandteile werden in das Lösungsmittel extrahiert, das anschließend als hochgeladene Tröpfchen verdampft und dabei hochgeladene Ionen bildet. Nach der Ionisation gelangen die Ionen in die Atmosphärendruckschnittstelle des Massenspektrometers. DESI ermöglicht die Ionisation von Proben unter Umgebungsbedingungen mit minimalem Probenvorbereitungsaufwand.

Diagramm einer SESI-Umgebungsionisationsquelle

Die extraktive Elektrospray-Ionisation ist eine Sprühionisationsmethode, die unter Umgebungsbedingungen arbeitet und zwei überlagerte Sprühstrahlen nutzt, von denen einer durch Elektrospray erzeugt wird. [ 49 ]

Die laserbasierte Elektrospray-Ionisation ist ein zweistufiges Verfahren, bei dem ein gepulster Laser Material von einer Probe desorbiert oder abträgt. Die entstehende Materialwolke interagiert anschließend mit einem Elektrospray und erzeugt so Ionen. [ 49 ] Bei der Ambient-Ionisation wird das Probenmaterial auf einem Target in der Nähe des Elektrosprays aufgebracht. Der Laser desorbiert oder abträgt Material von der Probe, das von der Oberfläche in den Elektrospray ausgestoßen wird und dort hochgeladene Ionen erzeugt. Beispiele hierfür sind die Elektrospray-Laserdesorptionsionisation (ELDI) , die matrixunterstützte Laserdesorptions-Elektrospray-Ionisation (MALDI) und die Laserablations-Elektrospray-Ionisation (LA-ESI) .

SESI-MS SUPER SESI gekoppelt mit Thermo Fisher Scientific-Orbitrap

Die elektrostatische Sprühionisation (ESTASI) ermöglicht die Analyse von Proben auf flachen oder porösen Oberflächen oder in Mikrokanälen. Dabei wird ein Analyten enthaltender Tropfen auf die Probenfläche aufgebracht und mit einer gepulsten Hochspannung beaufschlagt. Sobald der elektrostatische Druck die Oberflächenspannung übersteigt, werden Tropfen und Ionen versprüht.

Die sekundäre Elektrospray-Ionisation (SESI) ist eine Sprühionisationsmethode, bei der geladene Ionen mittels Elektrospray erzeugt werden. Diese Ionen laden dann Dampfmoleküle in der Gasphase beim Aufprall auf. [ 53 ] [ 54 ]

Bei der Papierspray-Ionisation wird die Probe auf ein Stück Papier aufgetragen, Lösungsmittel hinzugefügt und eine Hochspannung an das Papier angelegt, wodurch Ionen erzeugt werden.

Anwendungen

Die Außenseite der Elektrospray-Schnittstelle eines LTQ-Massenspektrometers.

Die Elektrospray-Ionisation wird zur Untersuchung der Proteinfaltung eingesetzt . [ 55 ] [ 56 ] [ 57 ]

Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie

Die Elektrospray-Ionisation (ESI) ist die bevorzugte Ionenquelle zur Kopplung von Flüssigkeitschromatographie mit Massenspektrometrie (LC-MS). Die Analyse kann online erfolgen, indem die von der LC-Säule eluierende Flüssigkeit direkt in den Elektrospray geleitet wird, oder offline, indem Fraktionen gesammelt und später in einem klassischen Nano-Elektrospray-Massenspektrometrie-System analysiert werden. Unter den zahlreichen Betriebsparametern der ESI-MS wurde für Proteine ​​[ 58 ] die Elektrospray-Spannung als wichtiger Parameter für die Gradientenelution in der ESI-LC/MS identifiziert [59]. Der Einfluss verschiedener Lösungsmittelzusammensetzungen [ 60 ] ( wie z. B. Trifluoressigsäure [ 61 ] oder Ammoniumacetat [ 22 ] , Supercharging-Reagenzien [ 62–65 ] oder Derivatisierungsgruppen [ 66 ] ) oder Sprühbedingungen [ 67 ] auf Elektrospray- LCMS -Spektren und/oder Nano-ESI- MS - Spektren wurde untersucht . [ 68 ] wurden untersucht.

Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS)

Die Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie wurde durch eine ESI-Schnittstelle ermöglicht, die von Richard D. Smith und Mitarbeitern am Pacific Northwest National Laboratory entwickelt und patentiert wurde und sich als breit anwendbar für die Analyse von sehr kleinen Gemischen biologischer und chemischer Verbindungen, ja sogar bis hin zu einer einzelnen biologischen Zelle, erwiesen hat.

Nichtkovalente Gasphasenwechselwirkungen

Die Elektrospray-Ionisation wird auch zur Untersuchung nichtkovalenter Wechselwirkungen in der Gasphase eingesetzt. Man geht davon aus, dass das Elektrospray-Verfahren nichtkovalente Komplexe aus der flüssigen Phase in die Gasphase überführen kann, ohne die nichtkovalente Wechselwirkung zu beeinträchtigen. Probleme [ 22 ] [ 69 ] , wie z. B. unspezifische Wechselwirkungen [ 70 ], wurden bei der Untersuchung von Ligand-Substrat-Komplexen mittels ESI-MS oder nanoESI-MS identifiziert. Ein interessantes Beispiel hierfür ist die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Enzymen und Wirkstoffen, die Inhibitoren des jeweiligen Enzyms sind. [ 71 ] [ 72 ] [ 73 ] In Wettbewerbsstudien zwischen STAT6 und Inhibitoren [ 73 ] [ 74 ] [ 75 ] wurde ESI zur Identifizierung potenzieller neuer Wirkstoffkandidaten eingesetzt.

Die Elektrospray-Ionisation kann sogar zur Untersuchung von Proteinkomplexen >1 MDa verwendet werden. [ 76 ] [ 16 ]

Siehe auch

Referenzen

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  29. ^ de la Mora Fernandez (2000). „Die Elektrospray-Ionisation großer, mehrfach geladener Spezies verläuft über den Dole-Mechanismus geladener Reste“. Analytica Chimica Acta . 406 : 93–104 . Bibcode : 2000AcAC..406...93F . doi : 10.1016/S0003-2670(99)00601-7 . Die Daten zeigen einen nahezu diskontinuierlichen Sprung im beobachteten m/z-Wert für eine Masse zwischen 20.000 und 50.000. Es liegt nahe, zu schlussfolgern, dass dies auf einen entsprechenden Übergang zurückzuführen ist, bei dem sich der Ionisationsmechanismus ändert. Dies entspräche einem kritischen z-Wert in der Nähe von 50 und einem entsprechenden elektrischen Feld von 2,6 V/nm. Selbstverständlich ist dies rein hypothetisch, und es gibt bisher keinerlei überzeugende Beweise dafür, dass ein Ion mit bis zu 30 Ladungen durch Feldverdampfung erzeugt werden kann. 
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