Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ( HPLC ), früher auch als Hochdruckflüssigkeitschromatographie bezeichnet , ist eine chromatographische Technik in der analytischen Chemie, die zur Trennung, Identifizierung und Quantifizierung spezifischer Komponenten ( Analyten ) in Gemischen eingesetzt wird. Die Gemische können aus Lebensmitteln , Chemikalien , Pharmazeutika ^{[ 1 ]} , biologischen , Umwelt- und landwirtschaftlichen Proben usw. stammen, wobei die zu analysierende Probe entweder flüssig ist oder in einer Flüssigkeit gelöst wurde. ^{[ 2 ]}

Die HPLC ist im Wesentlichen eine Druckchromatographie-Variante der Säulenchromatographie , bei der Druckpumpen anstelle der Schwerkraft sowie dünnere und längere Säulen mit kleineren Adsorptionsmittelpartikeln zum Einsatz kommen. Dadurch wird die analytische Auflösung erhöht.

Die HPLC findet breite Anwendung in der Herstellung ( z. B. bei der Produktion von pharmazeutischen und biologischen Produkten) ^{[ 3 ] [ 4 ],} im Rechtsbereich ( z. B. zum Nachweis von leistungssteigernden Substanzen im Urin) ^{[ 5 ]} , in der Forschung ( z. B. zur Trennung der Komponenten einer komplexen biologischen Probe oder ähnlicher synthetischer Chemikalien) und in der Medizin ( z. B. zur Bestimmung des Vitamin-D-Spiegels im Blutserum) ^{[ 6 ] .}

Hochdruckpumpen pressen Gemische verschiedener Lösungsmittel (die mobile Phase , z. B. Wasser, Puffer , Acetonitril und/oder Methanol ) durch eine Probenmischung, um Analyten aufzunehmen und in einen Zylinder (die Chromatographiesäule ) zu leiten. Die Säule ist mit festen Partikeln aus Adsorptionsmaterial (der stationären Phase ) gefüllt. Diese Partikel bestehen üblicherweise aus Siliciumdioxid oder Polymeren und haben einen Durchmesser von 1,5–50 μm. ^{[ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]} Die Elution erfolgt, während die mobile Phase die stationäre Phase durchströmt. Jede Komponente der Probe interagiert unterschiedlich mit dem Adsorptionsmaterial und den Lösungsmitteln, wodurch sich ihre Elutionsgeschwindigkeiten unterscheiden. ^{[ 2 ]} Diese unterschiedlichen Geschwindigkeiten führen zur analytischen Trennung der Substanzen im aus der Säule austretenden Eluat. Das Eluat gelangt in einen spezifischen Chromatographiedetektor, z. B. einen UV-Detektor , der ein Chromatogramm erzeugt . Ein Chromatogramm ist ein Diagramm der Detektorsignalintensität in Abhängigkeit von der Zeit oder dem Volumen der mobilen Phase. Sind die Analyten gut getrennt, zeigt das Chromatogramm gut getrennte Peaks, einen pro Analyt. Jeder Analyt erscheint zu seiner jeweiligen Zeit (Retentionszeit) mit einer Fläche, die proportional zu seiner Menge ist. ^{[ 7 ]}

Die Chromatographie kann als Stofftransportprozess beschrieben werden, der Adsorption und/oder Verteilung umfasst . Wie bereits erwähnt, nutzt die HPLC Pumpen, um eine unter Druck stehende Flüssigkeit und eine Probenmischung durch eine mit dem Adsorptionsmittel (der aktiven Komponente der Säule) gefüllte Säule zu leiten. Manche Analyten binden stärker an das Adsorptionsmittel als an das Eluent, während andere Analyten das Gegenteil tun. Das heißt, die Analyten können unterschiedliche Verteilungskoeffizienten aufweisen , was zu ihrer Trennung führt. Die Wechselwirkungen zwischen Analyt, fester und flüssiger Phase sind physikalisch oder chemisch reversibel und beruhen üblicherweise auf einer Kombination nicht-kovalenter Wechselwirkungen . ^{[ 10 ] [ 11 ]}

Die Flüssigkeitschromatographie ist komplex ^{[ 12 ]} und basiert auf anspruchsvoller und empfindlicher Technologie. Für den ordnungsgemäßen Betrieb des Systems ist ein grundlegendes Verständnis der Datenverarbeitungsprozesse erforderlich, um fehlerhafte Daten und verfälschte Ergebnisse zu vermeiden. ^{[ 13 ] [ 14 ] [ 15 ]}

Die HPLC unterscheidet sich von der herkömmlichen („Niederdruck-“) Flüssigkeitschromatographie durch die deutlich höheren Betriebsdrücke (ca. 50–1400 bar), während die herkömmliche Flüssigkeitschromatographie typischerweise die Schwerkraft nutzt, um die mobile Phase durch die gepackte Säule zu leiten. Aufgrund der geringen Probenmenge, die in der analytischen HPLC getrennt wird, betragen die typischen Säulenabmessungen 2,1–4,6 mm Durchmesser und 30–250 mm Länge. HPLC-Säulen werden zudem mit kleineren Adsorptionsmittelpartikeln (mittlere Partikelgröße 1,5–50 μm) hergestellt. Dies verleiht der HPLC ein überlegenes Auflösungsvermögen (die Fähigkeit, Verbindungen zu unterscheiden) bei der Trennung von Gemischen in kürzerer Zeit, was sie zu einer beliebten chromatographischen Technik macht. ^{[ 16 ]}

Das Schema eines HPLC-Geräts umfasst typischerweise Lösungsmittelbehälter, eine oder mehrere Pumpen, einen Lösungsmittel- Entgaser , einen Probengeber, eine Säule und einen Detektor. Die Lösungsmittel werden entsprechend den Trennanforderungen vorbereitet, durchlaufen den Entgaser zur Entfernung gelöster Gase, werden zur mobilen Phase vermischt und fließen dann durch den Probengeber. Dieser führt die Probenmischung dem mobilen Phasenstrom zu, der diese anschließend in die Säule transportiert. Die Pumpen fördern den gewünschten Fluss und die gewünschte Zusammensetzung der mobilen Phase durch die stationäre Phase in der Säule und direkt in eine Durchflusszelle im Detektor. Der Detektor erzeugt ein Signal proportional zur Menge der aus der Säule austretenden Probenkomponente und ermöglicht so die quantitative Analyse der Probenkomponenten. Der Detektor erfasst außerdem die Austrittszeit, die Retentionszeit, die der ersten Identifizierung der Komponente dient. Fortgeschrittenere Detektoren liefern darüber hinaus zusätzliche Informationen zu den spezifischen Eigenschaften des Analyten, wie z. B. UV/VIS- Spektren oder Massenspektren , die Aufschluss über dessen Struktur geben können. Diese Detektoren sind weit verbreitet, beispielsweise UV/Vis-Detektoren, Photodiodenarray -Detektoren (PDA) / Diodenarray-Detektoren und Massenspektrometrie- Detektoren. ^{[ 17 ] [ 18 ]}

Ein digitaler Mikroprozessor und eine Benutzersoftware steuern das HPLC-Gerät und ermöglichen die Datenanalyse. Einige Modelle mechanischer Pumpen in HPLC-Geräten können mehrere Lösungsmittel in zeitlich veränderlichen Verhältnissen mischen und so einen Konzentrationsgradienten in der mobilen Phase erzeugen . Neuere HPLC-Geräte verfügen über einen Säulenofen, der die Einstellung der Trenntemperatur erlaubt. ^{[ 19 ]}

Die zu trennende und zu analysierende Probenmischung wird in einem kleinen, diskreten Volumen (typischerweise Mikroliter) in den durch die Säule fließenden Strom der mobilen Phase eingeführt. Die Probenkomponenten bewegen sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die Säule. Diese Geschwindigkeiten hängen von spezifischen physikalischen Wechselwirkungen mit dem Adsorptionsmittel, der stationären Phase, ab. Die Geschwindigkeit jeder Komponente ist abhängig von ihrer chemischen Natur, der Beschaffenheit der stationären Phase (innerhalb der Säule) und der Zusammensetzung der mobilen Phase. Die Zeit, zu der ein bestimmter Analyt eluiert (die Säule verlässt), wird als Retentionszeit bezeichnet. Die unter bestimmten Bedingungen gemessene Retentionszeit ist ein identifizierendes Merkmal eines gegebenen Analyten.

Es sind viele verschiedene Säulentypen erhältlich, die mit Adsorbentien unterschiedlicher Partikelgröße, Porosität und Oberflächenchemie gefüllt sind. Die Verwendung von Packungsmaterialien mit kleinerer Partikelgröße erfordert einen höheren Betriebsdruck (Gegendruck) und verbessert typischerweise die chromatographische Auflösung (den Grad der Peaktrennung zwischen aufeinanderfolgenden Analyten, die die Säule verlassen). Die Sorptionsmittelpartikel können ionisch, hydrophob oder polar sein.

Die gebräuchlichste Methode der Flüssigkeitschromatographie ist die Umkehrphasenchromatographie . Dabei werden als mobile Phasen beliebige mischbare Kombinationen aus Wasser oder Puffern und verschiedenen organischen Lösungsmitteln verwendet (am häufigsten Acetonitril und Methanol). Einige HPLC-Techniken nutzen wasserfreie mobile Phasen (siehe Normalphasenchromatographie unten). Die wässrige Komponente der mobilen Phase kann Säuren (wie Ameisensäure, Phosphorsäure oder Trifluoressigsäure ) oder Salze enthalten, um die Trennung der Probenkomponenten zu unterstützen. Die Zusammensetzung der mobilen Phase kann während der chromatographischen Analyse konstant gehalten („isokratische Elution“) oder variiert werden („Gradientenelution“). Die isokratische Elution eignet sich typischerweise zur Trennung einfacher Gemische. Die Gradientenelution ist für komplexe Gemische mit unterschiedlichen Wechselwirkungen mit der stationären und der mobilen Phase erforderlich. Daher wird bei der Gradientenelution die Zusammensetzung der mobilen Phase typischerweise von niedriger zu hoher Elutionsstärke variiert. Die Elutionsstärke der mobilen Phase spiegelt sich in den Retentionszeiten der Analyten wider, da eine hohe Elutionsstärke die Elution beschleunigt (und somit die Retentionszeiten verkürzt). Beispielsweise könnte ein typisches Gradientenprofil in der Umkehrphasenchromatographie mit 5 % Acetonitril (in Wasser oder wässrigem Puffer) beginnen und innerhalb von 5–25 Minuten linear auf 95 % Acetonitril ansteigen. Auch Phasen konstanter Zusammensetzung der mobilen Phase (Plateau) können Teil eines Gradientenprofils sein. So kann die Zusammensetzung der mobilen Phase beispielsweise 1–3 Minuten lang konstant bei 5 % Acetonitril gehalten werden, gefolgt von einem linearen Anstieg auf 95 % Acetonitril.

Die gewählte Zusammensetzung der mobilen Phase hängt von der Intensität der Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Probenkomponenten („Analyten“) und der stationären Phase ab ( z. B. hydrophobe Wechselwirkungen in der Umkehrphasen-HPLC). Abhängig von ihrer Affinität zur stationären und mobilen Phase verteilen sich die Analyten während des Trennprozesses in der Säule zwischen diesen beiden Phasen. Dieser Verteilungsprozess ähnelt dem einer Flüssig-Flüssig-Extraktion , verläuft jedoch kontinuierlich und nicht schrittweise.

Im Beispiel mit einem Wasser/Acetonitril-Gradienten eluieren (lösen sich) die hydrophoberen Komponenten später, und sobald die mobile Phase reicher an Acetonitril wird ( d. h . in einer mobilen Phase zu einer stärker eluierenden Lösung wird), beschleunigt sich ihre Elution.

Die Wahl der mobilen Phasenkomponenten, der Additive (wie Salze oder Säuren) und der Gradientenbedingungen hängt von der Beschaffenheit der Säule und der Probenbestandteile ab. Häufig wird eine Reihe von Probeläufen mit der Probe durchgeführt, um die HPLC-Methode zu finden, die eine ausreichende Trennung ermöglicht.

Vor der HPLC nutzten Wissenschaftler flüssigkeitschromatographische Verfahren mit Säulenchromatographie. Flüssigkeitschromatographische Systeme waren aufgrund der von der Schwerkraft abhängigen Fließgeschwindigkeit der Lösungsmittel weitgehend ineffizient. Trennungen dauerten viele Stunden, mitunter sogar Tage. Die Gaschromatographie (GC) war damals zwar leistungsfähiger als die Flüssigkeitschromatographie (LC), jedoch war die Trennung und Analyse hochpolarer Biopolymere mit hohem Molekulargewicht in der Gasphase offensichtlich unmöglich. ^{[ 20 ]} GC erwies sich für viele Anwendungen in den Lebenswissenschaften und im Gesundheitswesen als ineffektiv, da Biomoleküle meist nicht flüchtig und bei den hohen Temperaturen der GC thermisch instabil sind. ^{[ 21 ]} Daher wurden alternative Methoden entwickelt, die schließlich zur Entwicklung der HPLC führten.

Aufbauend auf den bahnbrechenden Arbeiten von Martin und Synge aus dem Jahr 1941 sagten Calvin Giddings ^{[ 22 ]} , Josef Huber und andere in den 1960er Jahren voraus, dass die Flüssigkeitschromatographie (LC) im Hocheffizienzmodus betrieben werden könnte, indem der Durchmesser der Packungspartikel deutlich unter den typischen LC- (und GC-)Wert von 150 μm reduziert und die Geschwindigkeit der mobilen Phase durch Druck erhöht wird. ^{[ 20 ]} Diese Vorhersagen wurden in den 1960er und 1970er Jahren bis heute intensiv experimentell überprüft und verfeinert. ^{[ 23 ]} Frühe Entwicklungsarbeiten zielten darauf ab, LC-Partikel zu verbessern, beispielsweise das wegweisende Zipax-Partikel, ein oberflächlich poröses Partikel. ^{[ 24 ]}

Die 1970er Jahre brachten zahlreiche Entwicklungen im Bereich Hardware und Instrumentierung. Forscher begannen, Pumpen und Injektoren für den Aufbau eines einfachen HPLC-Systems zu verwenden. ^{[ 25 ]} Gasverstärkerpumpen erwiesen sich als ideal, da sie mit konstantem Druck arbeiteten und für einen gleichmäßigen Fluss und eine gute Quantifizierung keine leckagefreien Dichtungen oder Rückschlagventile benötigten. ^{[ 21 ]} Bei DuPont IPD (Industrial Polymers Division) wurden wichtige Hardware-Meilensteine ​​erreicht, wie beispielsweise die Verwendung eines Gradientengeräts mit geringem Verweilvolumen sowie der Ersatz des Septum-Injektors durch ein Schleifen-Injektionsventil. ^{[ 21 ]}

Obwohl die Entwicklung der Instrumente wichtig war, dreht sich die Geschichte der HPLC primär um die Geschichte und Evolution der Partikeltechnologie . ^{[ 21 ] [ 26 ]} Nach der Einführung poröser Schichtpartikel bestand ein stetiger Trend zur Reduzierung der Partikelgröße, um die Effizienz zu steigern. ^{[ 21 ]} Mit der Verkleinerung der Partikelgröße traten jedoch neue Probleme auf. Die praktischen Nachteile resultieren aus dem hohen Druckabfall, der erforderlich ist, um die mobile Flüssigkeit durch die Säule zu pressen, und der Schwierigkeit, eine gleichmäßige Packung aus extrem feinen Materialien herzustellen. ^{[ 27 ]} Jede signifikante Reduzierung der Partikelgröße erfordert in der Regel eine weitere Instrumentenentwicklung, um den Druck zu bewältigen. ^{[ 23 ] [ 21 ]}

Die Verteilungschromatographie war eine der ersten von Chemikern entwickelten Chromatographiearten und wird heutzutage kaum noch angewendet. ^{[ 28 ]} Das Prinzip des Verteilungskoeffizienten findet Anwendung in der Papierchromatographie , Dünnschichtchromatographie sowie in der Gasphasen- und Flüssig-Flüssig-Trennung . Archer John Porter Martin und Richard Laurence Millington Synge erhielten 1952 den Nobelpreis für Chemie für die Entwicklung dieser Technik, die sie zur Trennung von Aminosäuren einsetzten . ^{[ 29 ]} Bei der Verteilungschromatographie wird ein Lösungsmittel auf der Oberfläche oder in den Körnern bzw. Fasern einer „inerten“ festen Trägermatrix zurückgehalten, ähnlich wie bei der Papierchromatographie. Alternativ nutzt die Methode Coulomb- und/oder Wasserstoffbrückenbindungen mit der stationären Phase. Die Analytmoleküle verteilen sich zwischen der flüssigen stationären Phase und dem Eluenten. Wie bei der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC; einer Untertechnik der HPLC) trennt dieses Verfahren die Analyten aufgrund ihrer unterschiedlichen Polarität. Bei der HILIC wird meist eine gebundene polare stationäre Phase und eine mobile Phase verwendet, die hauptsächlich aus Acetonitril mit Wasser als starker Komponente besteht. Die Partitions-HPLC wurde historisch auf ungebundenen Silica- oder Aluminiumoxidträgern eingesetzt. Beide Verfahren eignen sich zur Trennung von Analyten anhand ihrer relativen Polaritätsunterschiede. Gebundene Phasen in der HILIC bieten den Vorteil, saure , basische und neutrale Substanzen in einem einzigen chromatographischen Lauf zu trennen. ^{[ 30 ]}

Polare Analyten diffundieren in eine stationäre Wasserschicht, die mit der polaren stationären Phase assoziiert ist, und werden dadurch zurückgehalten. Je stärker die Wechselwirkungen zwischen dem polaren Analyten und der polaren stationären Phase (im Vergleich zur mobilen Phase) sind, desto länger ist die Elutionszeit. Die Stärke dieser Wechselwirkungen hängt von den funktionellen Gruppen der Molekülstruktur des Analyten ab. Stärker polarisierte Gruppen ( z. B. Hydroxylgruppen) und Gruppen, die Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden können, führen zu einer stärkeren Retention. Auch Coulomb- Wechselwirkungen (elektrostatische Wechselwirkungen) können die Retention erhöhen. Die Verwendung polarerer Lösungsmittel in der mobilen Phase verkürzt die Retentionszeit der Analyten, während hydrophobere Lösungsmittel sie tendenziell verlängern.

Die Normalphasenchromatographie (NP-HPLC) war eine der ersten HPLC-Methoden, die von Chemikern entwickelt wurden, ihre Anwendung hat jedoch in den letzten Jahrzehnten abgenommen. Diese Methode trennt Analyten anhand ihrer Affinität zu einer polaren stationären Oberfläche wie Silicagel. Sie basiert somit auf der Fähigkeit des Analyten, polare Wechselwirkungen (wie Wasserstoffbrückenbindungen oder Dipol-Dipol -Wechselwirkungen) mit der Sorptionsmitteloberfläche einzugehen. NP-HPLC verwendet eine unpolare, nicht-wässrige mobile Phase ( z. B. Chloroform ) und eignet sich gut zur Trennung von Analyten, die in unpolaren Lösungsmitteln leicht löslich sind. Der Analyt assoziiert mit der polaren stationären Phase und wird von dieser zurückgehalten. Die Adsorptionsstärke steigt mit zunehmender Polarität des Analyten. Die Wechselwirkungsstärke hängt nicht nur von den funktionellen Gruppen in der Struktur des Analytmoleküls ab, sondern auch von sterischen Faktoren . Der Einfluss der sterischen Hinderung auf die Wechselwirkungsstärke ermöglicht es dieser Methode, Strukturisomere zu trennen .

Die Verwendung polarerer Lösungsmittel in der mobilen Phase verkürzt die Retentionszeit der Analyten, während hydrophobere Lösungsmittel tendenziell eine langsamere Elution (längere Retentionszeiten) bewirken. Sehr polare Lösungsmittel, wie beispielsweise Spuren von Wasser in der mobilen Phase, adsorbieren an der festen Oberfläche der stationären Phase und bilden eine stationäre, gebundene (Wasser-)Schicht, die aktiv zur Retention beiträgt. Dieses Verhalten ist charakteristisch für die Normalphasenchromatographie, da es fast ausschließlich durch einen adsorptiven Mechanismus bestimmt wird ( d. h. , die Analyten interagieren mit einer festen Oberfläche und nicht mit der solvatisierten Schicht eines an die Sorptionsmitteloberfläche gebundenen Liganden; siehe auch Umkehrphasen-HPLC weiter unten). Die Adsorptionschromatographie wird nach wie vor zur Trennung von Strukturisomeren in Säulen- und Dünnschichtchromatographie auf aktiviertem (getrocknetem) Silicagel oder Aluminiumoxid eingesetzt.

Partitions- und NP-HPLC gerieten in den 1970er Jahren mit der Entwicklung der Umkehrphasen -HPLC aufgrund der schlechten Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten in Vergessenheit. Dies war auf die Anwesenheit einer Wasser- oder protischen organischen Lösungsmittelschicht auf der Oberfläche der Silica- oder Aluminiumoxid -Chromatographiemembranen zurückzuführen. Diese Schicht verändert sich mit jeder Änderung der Zusammensetzung der mobilen Phase ( z. B. des Feuchtigkeitsgehalts), was zu driftenden Retentionszeiten führt.

In jüngster Zeit hat die Verteilungschromatographie mit der Entwicklung von Hilic- gebundenen Phasen, die eine verbesserte Reproduzierbarkeit aufweisen, und aufgrund eines besseren Verständnisses des Anwendungsbereichs der Technik wieder an Popularität gewonnen.

Die Verdrängungschromatographie findet nur begrenzt Anwendung und wird hauptsächlich in der präparativen Chromatographie eingesetzt. Das Grundprinzip basiert auf einem Molekül mit hoher Affinität zur Chromatographiematrix (dem Verdränger), das effektiv um Bindungsstellen konkurriert und so alle Moleküle mit geringerer Affinität verdrängt. ^{[ 31 ]} Es bestehen deutliche Unterschiede zwischen Verdrängungs- und Elutionschromatographie. Im Elutionsmodus verlassen Substanzen die Säule typischerweise in schmalen, gaußförmigen Peaks. Für eine maximale Reinigung ist eine breite Peaktrennung, idealerweise bis zur Basislinie, erwünscht. Die Geschwindigkeit, mit der eine Komponente eines Gemisches im Elutionsmodus die Säule entlangwandert, hängt von vielen Faktoren ab. Damit zwei Substanzen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten wandern und dadurch getrennt werden können, müssen erhebliche Unterschiede in der Wechselwirkung zwischen den Biomolekülen und der Chromatographiematrix bestehen. Die Betriebsparameter werden so angepasst, dass dieser Unterschied optimal genutzt wird. In vielen Fällen lässt sich eine Basislinientrennung der Peaks nur mit Gradientenelution und geringer Säulenbeladung erreichen. Zwei Nachteile der Elutionschromatographie, insbesondere im präparativen Maßstab, sind die hohe Komplexität der Durchführung aufgrund des Gradientenpumpens und der geringe Durchsatz aufgrund der niedrigen Säulenbeladung. Die Verdrängungschromatographie bietet gegenüber der Elutionschromatographie den Vorteil, dass die Komponenten in aufeinanderfolgende Zonen reiner Substanzen anstatt in einzelne Peaks aufgetrennt werden. Da das Verfahren die Nichtlinearität der Isothermen nutzt, kann eine größere Menge an Säulenmaterial auf einer gegebenen Säule getrennt werden, wobei die gereinigten Komponenten in deutlich höherer Konzentration gewonnen werden.

Die Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC) ^{[ 32 ]} ist die am weitesten verbreitete chromatographische Methode. Sie verwendet eine unpolare stationäre Phase und eine wässrige, mäßig polare mobile Phase. RP-HPLC ist in der Biologie und den Lebenswissenschaften so weit verbreitet, dass sie oft einfach als „HPLC“ bezeichnet wird. Auch die pharmazeutische Industrie setzt RP-HPLC regelmäßig zur Qualifizierung von Arzneimitteln vor deren Markteinführung ein.

Bei Umkehrphasenmethoden werden Substanzen umso besser im System zurückgehalten, je hydrophober sie sind. Zur Retention organischer Materialien bestehen die stationären Phasen hauptsächlich aus porösen Kieselgelgranulaten, die in der Säule gepackt sind. Sie haben üblicherweise die Form von Kugeln mit unterschiedlichen Durchmessern (unter 2, 3, 5, 7, 10 μm ) und Porendurchmessern (60, 100, 150, 300 Å ). An ihrer Oberfläche befinden sich chemisch gebundene, geradkettige Alkyl-Liganden, beispielsweise C3, C4, C8 oder C18. Die Zahl gibt die Anzahl der Kohlenstoffatome im Liganden an. Ein C3-Ligand ist beispielsweise eine Propylgruppe . Je länger der Kohlenwasserstoff-Ligand an der stationären Phase ist, desto länger können die Probenkomponenten zurückgehalten werden. Die meisten gängigen Trennverfahren für biomedizinische Materialien verwenden eine C18-stationäre Phase, die auch unter Handelsnamen wie ODS (Octadecylsilan) oder RP-18 (Umkehrphase 18) bekannt ist. Zur Herstellung solcher stationärer Phasen wird die Oberfläche von Kieselgelpartikeln mit RMe₂SiCl behandelt _{, wobei R} eine geradkettige Alkylgruppe wie _{C₁₈H₃₇} oder _C₈H₁₇ ist .

Zur Trennung aromatischer Verbindungen oder allgemein von Verbindungen mit vielen Pi-Bindungen kann die stationäre Phase Phenyl- Oberflächenliganden aufweisen.

Bei einem pH-Wert < 2 kann sich die Bindung zwischen dem Liganden und dem Kieselgel lösen. Bei einem pH-Wert > 8 kann sich das Kieselgel selbst auflösen. Werden Lösungen mit extremen pH-Werten benötigt, kann die stationäre Phase aus mit organischen Substanzen polymerisiertem Kieselgel oder aus hydrophoben organischen Polymeren bestehen.

Bei solchen stationären Phasen ist die Retentionszeit für unpolare Moleküle länger, während polare Moleküle schneller eluieren (früher in der Analyse erscheinen). Ein Chromatograph kann die Retentionszeit verlängern, indem er der mobilen Phase mehr Wasser hinzufügt. Da Wasser stark polar ist, verstärkt es die Wechselwirkung des unpolaren Analyten mit der unpolaren stationären Phase. Umgekehrt kann ein Forscher die Retentionszeit verkürzen, indem er der mobilen Phase mehr organisches, unpolares Lösungsmittel hinzufügt.

Die RP-HPLC basiert auf dem Prinzip hydrophober Wechselwirkungen, die auf der hohen Symmetrie der dipolaren Wasserstruktur beruhen und in allen Prozessen der Lebenswissenschaften eine zentrale Rolle spielen. RP-HPLC ermöglicht die Messung dieser Wechselwirkungskräfte. Die Bindung des Analyten an die stationäre Phase ist proportional zur Kontaktfläche um den unpolaren Teil des Analytmoleküls nach der Assoziation mit dem Liganden auf der stationären Phase. Dieser solvophobe Effekt wird von der Kraft des Wassers dominiert, die zur „Hohlraumreduktion“ um den Analyten und die C_₁₈-Kette im Vergleich zum Komplex beider führt. Die dabei freigesetzte Energie ist proportional zur Oberflächenspannung des Eluenten (Wasser: 7,3 × 10 ^⁻⁶  J /cm² ^, Methanol: 2,2 × 10 ^⁻⁶  J/cm² ⁾ sowie zur hydrophoben Oberfläche des Analyten bzw. des Liganden. Die Retention kann durch Zugabe eines weniger polaren Lösungsmittels (Methanol, Acetonitril ) zur mobilen Phase verringert werden , um die Oberflächenspannung des Wassers zu reduzieren. Die Gradientenelution nutzt diesen Effekt, indem sie die Polarität und die Oberflächenspannung der wässrigen mobilen Phase während der Analyse automatisch verringert.

Die Struktur des Analytenmoleküls kann dessen Retentionsverhalten maßgeblich beeinflussen. Theoretisch kann ein Analyt mit einer größeren hydrophoben Oberfläche (C–H, C–C und generell unpolare Atombindungen, wie z. B. SS) länger zurückgehalten werden, da er weniger mit der Wasserstruktur interagiert. Analyten mit einer größeren polaren Oberfläche (aufgrund polarer Gruppen wie -OH, -NH₂, COO⁻ oder -NH₃⁺) werden hingegen _weniger gut ^{zurückgehalten} , _da ^sie besser in Wasser integriert sind. Die Wechselwirkungen mit der stationären Phase können auch durch sterische Effekte oder Ausschlussmechanismen beeinflusst werden. So kann der Zugang eines sehr großen Moleküls zu den Poren der stationären Phase eingeschränkt sein, wo die Wechselwirkungen mit Oberflächenliganden (Alkylketten) stattfinden. Eine solche Oberflächenhindernis führt typischerweise zu einer geringeren Retention.

Die Retentionszeit steigt mit zunehmender hydrophober (unpolarer) Oberfläche der Moleküle. Beispielsweise eluieren verzweigtkettige Verbindungen schneller als ihre entsprechenden linearen Isomere, da ihre Gesamtoberfläche kleiner ist. Ebenso eluieren organische Verbindungen mit C–C-Einfachbindungen häufig später als solche mit C=C- oder C≡C-Doppel- bzw. Dreifachbindungen, da die Doppel- oder Dreifachbindung das Molekül kompakter macht als eine Einfachbindung.

Ein weiterer wichtiger Faktor ist der pH-Wert der mobilen Phase , da dieser den hydrophoben Charakter des ionisierbaren Analyten verändern kann. Aus diesem Grund verwenden die meisten Methoden ein Puffermittel , wie beispielsweise Natriumphosphat , um den pH-Wert zu regulieren. Die Auswirkungen der pH-Wert-Regulierung und der Puffer variieren je nach Anwendung, verbessern aber im Allgemeinen die chromatographische Auflösung für ionisierbare Analyten. Puffer erfüllen mehrere Zwecke:

• Kontrolle des pH-Werts, der den Ionisationszustand der ionisierbaren Analyten beeinflusst.
• Die Ladung ionisierbarer Bereiche der Oberfläche der stationären Phase wird beeinflusst. Beispielsweise ist die Siliciumdioxid-Oberfläche zwischen den gebundenen Phasenliganden üblicherweise mit Silanolgruppen bedeckt , die deprotoniert werden können .
• Sie wirken als Ionenpaarungsmittel , um die Ladung des Analyten zu neutralisieren.

Wird die Massenspektrometrie zur Analyse des Eluats eingesetzt, wird dem Eluenten häufig eine flüchtige organische Säure wie Essigsäure oder Ameisensäure zugesetzt . Ammoniumformiat wird üblicherweise hinzugefügt, um die Detektion bestimmter Analyten durch die Bildung von Analyt-Ammonium- Addukten zu verbessern , die flüchtiger sind als die Analyten selbst.

Trifluoressigsäure (TFA) wird als Zusatzstoff zur mobilen Phase häufig für komplexe Gemische biomedizinischer Proben, vorwiegend Peptide und Proteine, eingesetzt, wobei meist UV-basierte Detektoren verwendet werden. TFA erhöht zudem die Retention von Analyten wie Carbonsäuren in Anwendungen mit anderen Detektoren (z. B. UV-VIS), da es sich um eine relativ starke organische Säure handelt. In massenspektrometrischen Methoden wird TFA jedoch selten verwendet, da Rückstände im Detektor und im Lösungsmittelzufuhrsystem die Analyse und Detektion stören können.

Die Silicapartikel in Umkehrphasenchromatographie (RP) sind im Vergleich zu Silicapartikeln in Normalphasenchromatographie (NP) weniger anfällig für Beschädigungen, da sie durch oberflächengebundene hydrophobe Liganden geschützt sind. Die meisten RP-Säulen bestehen jedoch aus alkylderivatisierten Silicapartikeln und neigen unter sauren Bedingungen (pH < 2) zur Hydrolyse des Silicas. Zudem löst sich Silica selbst unter alkalischen Bedingungen (pH > 8). Es gibt ausgewählte Marken von Hybrid- oder verstärkten Silicapartikeln für RP-Säulen, die auch unter extremen pH-Bedingungen eingesetzt werden können. Stark saure Bedingungen können außerdem die Metallteile der HPLC-Anlage korrodieren.

RP-HPLC-Säulen sollten in der Regel nach Gebrauch mit sauberem Lösungsmittel gespült werden, um Restsäuren oder Puffer zu entfernen, und anschließend in einem geeigneten Lösungsmittelgemisch gelagert werden. Für einige biomedizinische Anwendungen ist eine metallfreie Umgebung für eine optimale Trennung erforderlich. In solchen empfindlichen Fällen kann der Metallgehalt einer Säule durch Injektion einer Mischung aus 2,2'- und 4,4'- Bipyridin bestimmt werden . Da 2,2'-Bipyridin Metalle chelatieren kann , ist die Peakform des 2,2'-Bipyridin-Peaks verzerrt (ausgefranst), wenn Metallionen auf der Silicageloberfläche vorhanden sind .

Die Größenausschlusschromatographie ( SEC ) ^{[ 33 ]} trennt Polymermoleküle und Biomoleküle anhand ihrer unterschiedlichen Molekülgröße (genauer: ihres Stokes-Radius ). Der Trennprozess beruht auf der Fähigkeit der Probenmoleküle, die Poren von Gelkugeln in der Säule zu durchdringen, und ist abhängig von der relativen Größe der Analytmoleküle und der jeweiligen Porengröße des Adsorptionsmittels. Zudem setzt der Prozess voraus, dass keine Wechselwirkungen mit der Oberfläche des Packungsmaterials auftreten.

Es gibt 2 Haupttypen von SECs:

1. Gelpermeationschromatographie (GPC) – Trennung synthetischer Polymere (wasserlöslich oder organisch löslich) unter Verwendung vorwiegend organischer Lösungsmittel.
2. Gelfiltrationschromatographie (GFC) – Trennung von wasserlöslichen Biopolymeren (typischerweise Proteinen) unter Verwendung vorwiegend wässriger Lösungsmittel.

Das Trennprinzip der SEC beruht darauf, dass hochmolekulare Substanzen der Probe während ihres Transports durch die Säule vollständig oder teilweise in die porösen Partikel der stationären Phase eindringen. Das mobile Eluent wird so gewählt, dass Wechselwirkungen mit der Oberfläche der stationären Phase vollständig verhindert werden. Unter diesen Bedingungen gilt: Je kleiner das Molekül, desto besser kann es in den Porenraum eindringen und desto länger dauert der Transport durch die Säule. Je größer das Molekül hingegen, desto wahrscheinlicher ist es, dass es die Poren der stationären Phase nicht vollständig durchdringt, sondern diese umgeht und somit früher eluiert wird. Die Moleküle werden in der Reihenfolge abnehmender Molekularmasse getrennt, wobei die größten Moleküle zuerst und die kleineren später eluieren. Moleküle, die größer als die Porengröße sind, dringen gar nicht in die Poren ein und eluieren gemeinsam als erster Peak im Chromatogramm. Dieses Volumen wird als totales Ausschlussvolumen bezeichnet und definiert die Ausschlussgrenze der jeweiligen Säule. Kleine Moleküle durchdringen die Poren der stationären Phasenpartikel vollständig und werden zuletzt eluiert, was das Ende des Chromatogramms markiert und als Marker für die vollständige Durchdringung erscheinen kann.

In den biomedizinischen Wissenschaften gilt die Größenausschlusschromatographie (SEC) allgemein als Chromatographie mit niedriger Auflösung und wird daher häufig für den letzten, „polierenden“ Reinigungsschritt eingesetzt. Sie eignet sich auch zur Bestimmung der Tertiär- und Quartärstruktur gereinigter Proteine. SEC wird primär zur Analyse großer Moleküle wie Proteine ​​oder Polymere verwendet. Sie funktioniert auch präparativ, indem kleinere Moleküle in den Poren von Partikeln zurückgehalten werden. Größere Moleküle passieren die Poren, da sie zu groß sind, um in sie einzudringen. Größere Moleküle fließen daher schneller durch die Säule als kleinere: Je kleiner das Molekül, desto länger die Retentionszeit.

Diese Technik wird häufig zur Molekulargewichtsbestimmung von Polysacchariden eingesetzt. SEC ist die offizielle Methode der Europäischen Pharmakopöe zum Vergleich der Molekulargewichte verschiedener handelsüblicher niedermolekularer Heparine . ^{[ 34 ]}

Die Ionenaustauschchromatographie ( IEC ) oder Ionenchromatographie ( IC ) ^{[ 35 ]} ist eine Analysetechnik zur Trennung und Bestimmung von ionischen gelösten Stoffen in wässrigen Proben aus Umwelt- und Industriequellen wie der Metallindustrie, industriellen Abwässern, biologischen Systemen, pharmazeutischen Proben, Lebensmitteln usw.

Bei der Ionenchromatographie (IEC) sind elektrisch geladene Stellen an die stationäre Phase gebunden. Ionen, die die gleiche Ladung wie die Ionen auf der Säule tragen, werden abgestoßen und eluieren ohne Retention, während Ionen mit einer entgegengesetzten Ladung an der Säule zurückgehalten werden. Im Allgemeinen werden Ionen mit höherer Ladung und kleinerem Radius stärker zurückgehalten. Die an der Säule zurückgehaltenen Ionen können durch Änderung der Zusammensetzung der mobilen Phase eluiert werden, beispielsweise durch Erhöhung der Salzkonzentration und des pH-Werts oder durch Erhöhung der Temperatur der stationären Phase.

Zu den Ionenaustauschern zählen Polystyrolharze , Cellulose- und Dextran- Ionenaustauscher (Gele) sowie porenfreies Glas oder poröses Kieselgel . Polystyrolharze ermöglichen Vernetzungen, wodurch die Stabilität der Ionenketten erhöht wird. Ein höherer Vernetzungsgrad reduziert die Kettenverwirbelung, was die Einstellungszeit verlängert und letztendlich die Selektivität verbessert. Cellulose- und Dextran-Ionenaustauscher weisen größere Porengrößen und geringe Ladungsdichten auf und eignen sich daher für die Proteintrennung.

Eine Erhöhung der Gegenionenkonzentration (bezogen auf die funktionellen Gruppen in Harzen) verkürzt die Retentionszeit, da sie eine starke Konkurrenz mit den gelösten Ionen erzeugt. Eine pH-Wert-Senkung verkürzt die Retentionszeit beim Kationenaustausch, während eine pH-Wert-Erhöhung die Retentionszeit beim Anionenaustausch verkürzt. Durch Absenken des pH-Werts des Lösungsmittels in einer Kationenaustauschsäule stehen beispielsweise mehr Wasserstoffionen zur Verfügung, die um Bindungsstellen an der anionischen stationären Phase konkurrieren und dadurch schwach gebundene Kationen eluieren.

Diese Form der Chromatographie findet breite Anwendung in folgenden Bereichen: Wasserreinigung, Vorkonzentrierung von Spurenkomponenten, Ligandenaustauschchromatographie, Ionenaustauschchromatographie von Proteinen, Anionenaustauschchromatographie von Kohlenhydraten und Oligosacchariden bei hohem pH-Wert und andere.

Die Hochleistungs-Affinitätschromatographie (HPAC) ^{[ 36 ]} funktioniert, indem eine Probenlösung durch eine Säule geleitet wird, die mit einer stationären Phase gefüllt ist, welche einen immobilisierten, biologisch aktiven Liganden enthält. Der Ligand ist ein Substrat mit spezifischer Bindungsaffinität zum Zielmolekül in der Probenlösung. Das Zielmolekül bindet an den Liganden, während die übrigen Moleküle der Probenlösung die Säule passieren und nur geringfügig oder gar nicht zurückgehalten werden. Anschließend wird das Zielmolekül mit einem geeigneten Elutionspuffer von der Säule eluiert.

Dieses chromatographische Verfahren beruht auf der Fähigkeit der gebundenen Wirkstoffe, dank ihrer biologischen Erkennung bestimmter Probenbestandteile stabile, spezifische und reversible Komplexe zu bilden. Die Bildung dieser Komplexe erfolgt unter Beteiligung gängiger molekularer Kräfte wie Van -der-Waals-Wechselwirkungen , elektrostatischer Wechselwirkungen, Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, hydrophober Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen. Durch das gleichzeitige und koordinierte Wirken mehrerer dieser Kräfte an den komplementären Bindungsstellen entsteht eine effiziente, spezifische Bindung.

Die wässrige Normalphasenchromatographie ( ANP ) wird auch als hydrophile Interaktionschromatographie ( HILIC ) bezeichnet. ^{[ 37 ]} Diese chromatographische Technik deckt den mobilen Phasenbereich zwischen der Umkehrphasenchromatographie (RP) und der organischen Normalphasenchromatographie (ONP) ab. HILIC ermöglicht eine einzigartige Selektivität für hydrophile Verbindungen ^{[ 38 ]} und zeigt die Elutionsreihenfolge der Normalphase. Dabei werden „Umkehrphasen-Lösungsmittel“ verwendet, d. h. relativ polare, meist nicht-wässrige Lösungsmittel in der mobilen Phase. ^{[ 37 ]} Viele biologische Moleküle, insbesondere solche in Körperflüssigkeiten, sind kleine polare Verbindungen, die in der Umkehrphasen-HPLC schlecht zurückgehalten werden. Daher stellt die hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) eine attraktive und nützliche Alternative zur Analyse polarer Moleküle dar. Da HILIC routinemäßig mit herkömmlichen wässrigen Gemischen aus polaren organischen Lösungsmitteln wie Acetonitril (ACN) und Methanol verwendet wird, lässt sie sich zudem problemlos mit der Massenspektrometrie (MS) koppeln. ^{[ 38 ]}

Während der Trennung kann die Zusammensetzung der mobilen Phase gleich bleiben oder sich ändern. Bleibt sie gleich, spricht man von isokratischer Trennung (d. h. Trennung mit konstanter Zusammensetzung ). Dieser Begriff wurde von Csaba Horvath geprägt , einem der Pioniere der HPLC. ^{[ 39 ] [ 40 ]}

Ändert sich die Zusammensetzung, spricht man von Gradientenelution . ^{[ 41 ] [ 42 ]} Beispielsweise kann ein Gradient mit 10 % Methanol in Wasser beginnen und nach 20 Minuten bei 90 % Methanol in Wasser enden. Die beiden Komponenten der mobilen Phase werden üblicherweise als „A“ und „B“ bezeichnet; A ist das „schwache“ Lösungsmittel, das die Elution des Analyten nur langsam ermöglicht, während B das „starke“ Lösungsmittel ist, das die Analyten schnell von der Säule eluiert. In der Umkehrphasenchromatographie ist Lösungsmittel A häufig Wasser oder ein wässriger Puffer, während B ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel wie Acetonitril , Methanol, THF oder Isopropanol ist .

Bei der isokratischen Elution nimmt die Peakbreite mit der Retentionszeit linear gemäß der Gleichung für N (die Anzahl der theoretischen Böden) zu. Dies kann ein erheblicher Nachteil sein, wenn Proben mit Analyten mit einem breiten Spektrum an Retentionsfaktoren analysiert werden. Die Verwendung einer schwächeren mobilen Phase verlängert die Laufzeit und führt zu breiten Peaks bei langsam eluierenden Analyten, was die Empfindlichkeit verringert. Eine stärkere mobile Phase würde zwar die Laufzeit und die Verbreiterung späterer Peaks verbessern, führt aber zu einer geringeren Peaktrennung, insbesondere bei schnell eluierenden Analyten, die möglicherweise nicht genügend Zeit für eine vollständige Trennung haben. Dieses Problem wird durch die Variation der mobilen Phasenzusammensetzung bei der Gradientenelution gelöst.

Durch die Gradientenelution, die mit einer schwächeren mobilen Phase beginnt und diese während der Laufzeit verstärkt, wird die Retention der später eluierenden Komponenten verringert, sodass diese schneller eluieren. Dies führt zu schmaleren (und höheren) Peaks für die meisten Komponenten, während gleichzeitig eine ausreichende Trennung der früher eluierenden Komponenten ermöglicht wird. Zudem verbessert sich die Peakform bei Peaks mit Ausläufern, da die steigende Konzentration des organischen Eluenten den Ausläufer eines Peaks nach vorne verschiebt. Dadurch erhöht sich auch die Peakhöhe (der Peak erscheint „schärfer“), was in der Spurenanalytik wichtig ist. Das Gradientenprogramm kann plötzliche, stufenweise Erhöhungen des Anteils der organischen Komponente oder unterschiedliche Steigungen zu verschiedenen Zeitpunkten beinhalten – alles je nach dem Ziel einer optimalen Trennung in minimaler Zeit.

Bei der isokratischen Elution bleibt die Retentionsreihenfolge unverändert, wenn sich die Säulendimensionen (Länge und Innendurchmesser) ändern – die Peaks eluieren also in derselben Reihenfolge. Bei der Gradientenelution hingegen kann sich die Elutionsreihenfolge ändern, wenn sich die Dimensionen oder die Flussrate ändern, sofern diese nicht entsprechend angepasst werden ^{[ 43 ].}

Die treibende Kraft in der Umkehrphasenchromatographie liegt in der hohen Ordnung der Wasserstruktur. Die Rolle der organischen Komponente der mobilen Phase besteht darin, diese hohe Ordnung zu verringern und somit die retardierende Wirkung der wässrigen Komponente zu reduzieren.

Die Theorie der allgemeinen Chromatographie ist auch auf die HPLC anwendbar. ^{[ 44 ]} Diese Theorie bildet die Grundlage für die Systemtauglichkeitsprüfungen des Arzneibuchs der Vereinigten Staaten [ ^{45 ] ,} bei denen es sich um eine Reihe quantitativer Kriterien handelt, die die Eignung eines HPLC-Systems für die erforderliche Analyse in jedem einzelnen Schritt bewerten.

Diese Beziehung wird auch als normierter, dimensionsloser Faktor, der sogenannte Retentionsfaktor oder Retentionsparameter, dargestellt. Er entspricht der experimentellen Messung des Kapazitätsverhältnisses, wie auch in der Abbildung der Leistungskriterien gezeigt. t_{_R} ist die Retentionszeit der jeweiligen Komponente und t_₀ die Zeit, die eine nicht-retinierte Substanz benötigt, um ohne Retention durch das System zu eluieren; daher wird sie auch als Leerzeit bezeichnet.

Das Verhältnis der Retentionsfaktoren k' von je zwei benachbarten Peaks im Chromatogramm wird zur Beurteilung des Trennungsgrades zwischen ihnen verwendet und wird als Selektivitätsfaktor α bezeichnet, wie im Diagramm der Leistungskriterien dargestellt.

Die Bodenzahl N als Kriterium für die Systemeffizienz wurde für isokratische Bedingungen entwickelt, d. h. für eine konstante Zusammensetzung der mobilen Phase während des gesamten Laufs. Unter Gradientenbedingungen, bei denen sich die mobile Phase während des chromatographischen Laufs ändert, ist die Peak-Kapazität P_{_c} als Maß für die Systemeffizienz besser geeignet. ^{[ 46 ]} Die Peak-Kapazität in der Chromatographie ist definiert als die Anzahl der Peaks, die innerhalb eines Retentionsfensters für einen bestimmten, vordefinierten Auflösungsfaktor (üblicherweise ~1) getrennt werden können. Sie kann auch als Laufzeit, gemessen in Anzahl der mittleren Peakbreiten, betrachtet werden. Die Gleichung ist in der Abbildung der Leistungskriterien dargestellt. In dieser Gleichung ist t_g die Gradientenzeit und w_ave die mittlere Peakbreite an der Basis.

Die Parameter basieren größtenteils auf zwei chromatographischen Theorien: der Plattentheorie (im Rahmen der Verteilungschromatographie ) und der Geschwindigkeitstheorie der Chromatographie/ van-Deemter-Gleichung . Sie lassen sich selbstverständlich durch die Analyse von HPLC-Chromatogrammen praktisch anwenden, wobei die Geschwindigkeitstheorie als genauer gilt.

Sie sind analog zur Berechnung des Retentionsfaktors bei der Papierchromatographie , beschreiben aber, wie gut die HPLC ein Gemisch in zwei oder mehr Komponenten trennt, die als Peaks (Banden) im Chromatogramm detektiert werden. Die HPLC-Parameter sind der Effizienzfaktor ( N ), der Retentionsfaktor (κ') und der Trennfaktor (α). Zusammen bilden diese Faktoren Variablen in einer Auflösungsgleichung, die beschreibt, wie gut die Peaks zweier Komponenten getrennt sind oder sich überlappen. Diese Parameter werden hauptsächlich zur Beschreibung von HPLC-Umkehrphasen- und HPLC-Normalphasentrennungen verwendet, da diese Trennungen tendenziell subtiler sind als andere HPLC-Modi ( z. B. Ionenaustausch und Größenausschlusschromatographie).

Das Leervolumen ist der Raum in einer Säule, der vom Lösungsmittel eingenommen wird. Es ist der Raum innerhalb der Säule außerhalb des Füllmaterials. Das Leervolumen wird im Chromatogramm als erster detektierter Peak gemessen, üblicherweise das im Probengemisch enthaltene Lösungsmittel. Idealerweise durchströmt das Lösungsmittel die Säule, ohne mit ihr zu interagieren, ist aber dennoch vom HPLC-Lösungsmittel unterscheidbar. Das Leervolumen dient als Korrekturfaktor.

Der Effizienzfaktor ( N ) misst die Schärfe der Komponentenpeaks im Chromatogramm. Er wird als Verhältnis der Peakfläche (Retentionszeit) zur Peakbreite an der breitesten Stelle (Basislinie) angegeben. Hohe, scharfe und relativ schmale Peaks deuten auf eine effiziente Trennung der Komponenten aus dem Gemisch hin; die Effizienz ist hoch. Sie hängt stark von der verwendeten HPLC-Säule und -Methode ab. Der Effizienzfaktor ist gleichbedeutend mit der Bodenzahl und der Anzahl der theoretischen Böden.

Der Retentionsfaktor ( Kappa-Prime ) gibt an, wie lange eine Komponente des Gemisches an der Säule verbleibt. Dies wird anhand der Fläche unter der Kurve ihres Peaks im Chromatogramm gemessen (da HPLC-Chromatogramme zeitabhängig sind). Jeder Peak im Chromatogramm besitzt einen eigenen Retentionsfaktor ( z. B. Kappa 1 für den Retentionsfaktor des ersten Peaks). Dieser Faktor kann durch das Totvolumen der Säule korrigiert werden.

Der Trennfaktor ( α ) ist ein relativer Vergleich, der angibt, wie gut zwei benachbarte Komponenten eines Gemisches getrennt wurden ( d. h . zwei benachbarte Banden in einem Chromatogramm). Dieser Faktor wird als Verhältnis der Retentionsfaktoren zweier benachbarter Chromatogrammpeaks definiert und kann gegebenenfalls durch das Totvolumen der Säule korrigiert werden. Je größer der Wert des Trennfaktors über 1,0 liegt, desto besser ist die Trennung. Ab einem Wert von etwa 2,0 ist eine HPLC-Methode zur Trennung wahrscheinlich nicht mehr erforderlich. Auflösungsgleichungen setzen die drei Faktoren in Beziehung, sodass hohe Effizienz und hohe Trennfaktoren die Auflösung der Komponentenpeaks in einer HPLC-Trennung verbessern.

Der Innendurchmesser (ID) einer HPLC-Säule ist ein wichtiger Parameter. ^{[ 47 ]} Bei Verringerung des Durchmessers kann die Detektionsempfindlichkeit aufgrund der reduzierten lateralen Diffusion des Analytenbandes beeinträchtigt werden. Auch die Trennselektivität kann sich verändern, wenn Flussrate und Injektionsvolumen nicht proportional zum kleineren oder größeren Durchmesser angepasst werden, sowohl im isokratischen als auch im Gradientenmodus. ^{[ 48 ]} Er bestimmt die Menge des auf die Säule geladenen Analyten. Säulen mit größerem Durchmesser werden üblicherweise in präparativen Anwendungen eingesetzt, beispielsweise zur Aufreinigung eines Arzneimittels für die spätere Verwendung. ^{[ 49 ]} Säulen mit kleinem ID weisen in der modernen Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPLC) eine verbesserte Empfindlichkeit und einen geringeren Lösungsmittelverbrauch auf. ^{[ 50 ]}

Säulen mit größerem Innendurchmesser (über 10 mm) werden aufgrund ihrer hohen Beladungskapazität zur Reinigung nutzbarer Materialmengen eingesetzt.

Analytische Säulen (4,6 mm) sind nach wie vor der gebräuchlichste Säulentyp, obwohl schmalere Säulen zunehmend an Beliebtheit gewinnen. ^{[ 50 ]} Sie werden in der traditionellen quantitativen Probenanalyse eingesetzt und verwenden häufig einen UV/Vis-Absorptionsdetektor .

Säulen mit engem Innendurchmesser (1–2 mm) werden für Anwendungen eingesetzt, bei denen eine höhere Empfindlichkeit gewünscht ist, entweder mit speziellen UV/Vis-Detektoren, Fluoreszenzdetektion oder mit anderen Detektionsmethoden wie der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie.

Kapillarsäulen (unter 0,3 mm) werden fast ausschließlich in Verbindung mit alternativen Detektionsverfahren wie der Massenspektrometrie eingesetzt . Sie bestehen üblicherweise aus Quarzglaskapillaren und nicht aus Edelstahlrohren, wie sie bei größeren Säulen verwendet werden.

Die meisten herkömmlichen HPLC-Verfahren werden mit einer stationären Phase durchgeführt, die an der Außenseite kleiner, kugelförmiger Silicapartikel (sehr kleiner Kügelchen) gebunden ist . Diese Partikel sind in verschiedenen Größen erhältlich, wobei 5-µm-Kügelchen am häufigsten vorkommen. Kleinere Partikel bieten im Allgemeinen eine größere Oberfläche und bessere Trennungen, jedoch steigt der für eine optimale lineare Geschwindigkeit erforderliche Druck umgekehrt proportional zum Quadrat des Partikeldurchmessers. ^{[ 51 ] [ 52 ] [ 53 ]}

Gemäß den Gleichungen ^{[ 54 ]} für Säulengeschwindigkeit, Effizienz und Gegendruck führt eine Halbierung des Partikeldurchmessers bei gleichbleibender Säulengröße zu einer Verdopplung von Säulengeschwindigkeit und Effizienz, jedoch zu einer Vervierfachung des Gegendrucks. Kleine Partikel können zudem die Bandenverbreiterung in der HPLC verringern. ^{[ 55 ]} Größere Partikel werden in der präparativen HPLC (Säulendurchmesser 5 cm bis >30 cm) und für Nicht-HPLC-Anwendungen wie die Festphasenextraktion eingesetzt .

Viele stationäre Phasen sind porös, um eine größere Oberfläche zu bieten. Kleine Poren ermöglichen eine größere Oberfläche, während größere Poren eine bessere Kinetik aufweisen, insbesondere für größere Analyten. Beispielsweise kann ein Protein, das nur geringfügig kleiner als eine Pore ist, zwar in die Pore eindringen, aber nach dem Eindringen nicht mehr so ​​leicht wieder austreten.

Pumpen unterscheiden sich in ihrer Druckkapazität, ihre Leistung wird jedoch anhand ihrer Fähigkeit gemessen, einen gleichmäßigen und reproduzierbaren Volumenstrom zu liefern . Der Druck kann bis zu 60 MPa (6000  lbf/in² ⁾ oder etwa 600 Atmosphären erreichen. Moderne HPLC-Systeme wurden für deutlich höhere Drücke optimiert und können daher wesentlich kleinere Partikelgrößen in den Säulen (<2 μm) verwenden. Diese „Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie“-Systeme (UHPLC), die auch als Ultrahochdruckchromatographie-Systeme bekannt sind ^{[ 56 ]} , können bei Drücken von bis zu 120 MPa (17.405 lbf/in²) oder etwa 1200 Atmosphären arbeiten ^[ 57]. ^{Der Begriff „} UPLC“ ^{[ 58 ]} ist eine Marke der Waters Corporation , wird aber manchmal auch als Bezeichnung für die allgemeinere UHPLC-Technik verwendet.

HPLC-Detektoren lassen sich in zwei Hauptkategorien einteilen: universelle und selektive Detektoren. Universelle Detektoren messen typischerweise eine Stoffeigenschaft ( z. B. den Brechungsindex ), indem sie die Differenz einer physikalischen Eigenschaft zwischen der mobilen Phase und der mobilen Phase mit dem Analyten erfassen. Selektive Detektoren hingegen messen eine Eigenschaft des Analyten ( z. B. die UV/Vis-Absorption ), indem sie auf dessen physikalische oder chemische Eigenschaften reagieren . ^{[ 59 ]} In der HPLC wird am häufigsten ein UV/Vis-Absorptionsdetektor verwendet ; es können jedoch auch zahlreiche andere Chromatographiedetektoren eingesetzt werden. Ein universeller Detektor, der die UV/Vis-Absorptionsdetektion ergänzt, ist der geladene Aerosoldetektor (CAD). Zu den häufig verwendeten Detektoren gehören Brechungsindexdetektoren, die Messwerte durch Messung der Brechungsindexänderung des Eluenten während seines Durchflusses durch die Durchflusszelle liefern. In bestimmten Fällen können mehrere Detektoren eingesetzt werden; so kombiniert beispielsweise die LC-MS üblicherweise UV/Vis-Spektroskopie mit einem Massenspektrometer.

In Kombination mit einem elektrochemischen Detektor (ECD) ermöglicht die HPLC-ECD den selektiven Nachweis von Neurotransmittern wie Noradrenalin , Dopamin , Serotonin , Glutamat , GABA, Acetylcholin und anderen in neurochemischen Analyseverfahren. ^{[ 60 ]} Die HPLC-ECD detektiert Neurotransmitter bis in den Femtomolarbereich . Weitere Methoden zum Nachweis von Neurotransmittern sind die Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie, ELISA und Radioimmunoassay.

Eine große Anzahl von Proben kann mithilfe von HPLC-Autosamplern automatisch in ein HPLC-System injiziert werden. Da HPLC-Autosampler für jede Injektion ein exakt gleiches Injektionsvolumen und eine identische Injektionstechnik aufweisen, gewährleisten sie eine hohe Präzision des Injektionsvolumens. Es besteht die Möglichkeit, die Probe innerhalb der Probenkammer zu rühren und so die Homogenität zu fördern. ^{[ 61 ]}

Die HPLC findet vielfältige Anwendung in der Labor- und klinischen Forschung. Sie ist eine gängige Technik in der pharmazeutischen Entwicklung, da sie eine zuverlässige Methode zur Gewinnung und Sicherstellung der Produktreinheit darstellt. ^{[ 62 ]} Obwohl mit HPLC Produkte von extrem hoher Qualität (Reinheit) hergestellt werden können, ist sie nicht immer die primäre Methode bei der Herstellung von Wirkstoffen. ^{[ 63 ]} Laut Europäischem Arzneibuch wird HPLC nur in 15,5 % der Synthesen eingesetzt. ^{[ 64 ]} Im Arzneibuch der Vereinigten Staaten spielt sie hingegen in 44 % der Synthesen eine Rolle. ^{[ 65 ]} Dies könnte auf unterschiedliche Kosten und zeitliche Einschränkungen zurückzuführen sein, da HPLC im großen Maßstab eine kostspielige Technik sein kann. Die mit HPLC erzielbare Steigerung von Spezifität, Präzision und Genauigkeit geht leider mit höheren Kosten einher.

Diese Technik wird auch zum Nachweis illegaler Drogen in verschiedenen Proben eingesetzt. ^{[ 66 ]} Die gebräuchlichste Methode zum Drogennachweis ist der Immunassay . ^{[ 67 ]} Diese Methode ist deutlich komfortabler. Allerdings geht dieser Komfort mit einer geringeren Spezifität und Abdeckung eines breiten Spektrums an Drogen einher. Daher wird die HPLC als alternative Methode verwendet. Da die HPLC die Reinheit bestimmt (und gegebenenfalls erhöht), ist die alleinige Verwendung der HPLC zur Bestimmung der Drogenkonzentrationen nicht ausreichend. Daher wird die HPLC in diesem Zusammenhang häufig in Kombination mit der Massenspektrometrie eingesetzt . ^{[ 68 ]} Die Verwendung der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) anstelle der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) umgeht die Notwendigkeit der Derivatisierung mit Acetylierungs- oder Alkylierungsmitteln, die einen aufwändigen zusätzlichen Schritt darstellen kann. ^{[ 69 ]} LC-MS wurde zur Detektion einer Vielzahl von Substanzen wie Dopingmitteln, Arzneimittelmetaboliten, Glucuronidkonjugaten, Amphetaminen, Opioiden, Kokain, Benzodiazepinen, Ketamin, LSD, Cannabis und Pestiziden eingesetzt. ^{[ 70 ] [ 71 ]} Die Kombination von HPLC und Massenspektrometrie reduziert den absoluten Bedarf an Standardisierung von HPLC-Versuchsreihen.

Ähnliche Analysen können zu Forschungszwecken durchgeführt werden, um die Konzentrationen potenzieller klinischer Wirkstoffe wie Antimykotika und Asthmamedikamente zu bestimmen. ^{[ 72 ]} Diese Technik ist offensichtlich auch nützlich, um mehrere Spezies in gesammelten Proben zu beobachten, erfordert jedoch die Verwendung von Standardlösungen, wenn Informationen zur Speziesidentität gesucht werden. Sie wird als Methode zur Bestätigung von Synthesereaktionsergebnissen eingesetzt, da Reinheit in dieser Art von Forschung unerlässlich ist. Die Massenspektrometrie ist jedoch nach wie vor die zuverlässigere Methode zur Speziesidentifizierung.

In der Medizin wird die HPLC typischerweise mit einem Massenspektrometer (MS) als Detektor eingesetzt. Daher spricht man von LC-MS ^{[ 73 ]} oder LC-MS/MS für Tandem-MS, bei dem zwei MS-Systeme sequenziell betrieben werden ^{[ 74 ]} . Wenn ein HPLC-Gerät mit mehr als einem Detektor verbunden ist, spricht man von einem gekoppelten LC-System. Pharmazeutische Anwendungen ^{[ 75 ]} sind die Hauptanwender von HPLC, LC-MS und LC-MS/MS ^{[ 76 ]} . Dazu gehören die Arzneimittelentwicklung ^{[ 77 ]} und die Pharmakologie, die wissenschaftliche Untersuchung der Wirkungen von Arzneimitteln und Chemikalien auf lebende Organismen ^{[ 78 ]} , die personalisierte Medizin ^{[ 79 ]} , das öffentliche Gesundheitswesen ^{[ 80 ] [ 81 ]} und die Diagnostik ^{[ 82 ]} . Während Urin das am häufigsten verwendete Medium zur Analyse von Arzneimittelkonzentrationen ist, wird für die meisten medizinischen Analysen mit HPLC Blutserum als Probe verwendet. ^{[ 83 ]} Eine der wichtigsten Aufgaben der LC-MS und LC-MS/MS im klinischen Labor ist das Neugeborenenscreening (NBS) auf Stoffwechselstörungen ^{[ 84 ]} und die anschließende Diagnostik. ^{[ 85 ] [ 86 ]} Die Proben der Säuglinge liegen in Form von Trockenblutproben (DBS) vor, ^{[ 87 ]} die einfach zu präparieren und zu transportieren sind und somit eine sichere und zugängliche Diagnostik sowohl lokal als auch global ermöglichen.

Andere Methoden zum Nachweis von Molekülen, die für klinische Studien geeignet sind, wurden mit der HPLC verglichen, insbesondere Immunoassays. In einem Beispiel hierfür wurden kompetitive Proteinbindungsassays (CPBA) und HPLC hinsichtlich ihrer Sensitivität beim Nachweis von Vitamin D verglichen. Obwohl CPBA zur Diagnose von Vitamin-D-Mangel bei Kindern geeignet ist, erreichte die Sensitivität und Spezifität lediglich 40 % bzw. 60 % der Kapazität der HPLC. ^{[ 88 ]} Die HPLC ist zwar ein kostspieliges Verfahren, ihre Genauigkeit ist jedoch nahezu unübertroffen.

• Geschichte der Chromatographie
• Kapillarelektrochromatographie
• Säulenchromatographie
• Csaba Horváth
• Ionenchromatographie
• Mizellare Flüssigkeitschromatographie

• LR Snyder, JJ Kirkland und JW Dolan, Einführung in die moderne Flüssigkeitschromatographie, John Wiley & Sons, New York, 2009.
• MW Dong, Moderne HPLC für praktizierende Wissenschaftler. Wiley, 2006.
• LR Snyder, JJ Kirkland und JL Glajch, Praktische HPLC-Methodenentwicklung, John Wiley & Sons, New York, 1997.
• S. Ahuja und HT Rasmussen (Hrsg.), HPLC Method Development for Pharmaceuticals, Academic Press, 2007.
• S. Ahuja und MW Dong (Hrsg.), Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC, Elsevier/Academic Press, 2005.
• YV Kazakevich und R. LoBrutto (Hrsg.), HPLC für Pharmazeutische Wissenschaftler, Wiley, 2007.
• UD Neue, HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice, Wiley-VCH, New York, 1997.
• MC McMaster, HPLC, ein praktischer Leitfaden für Anwender, Wiley, 2007.

• HPLC-Chromatographie: Prinzip und Anwendung [Grundlagen auf Rxlalit.com]