In der Genetik ist die Flp- FRT - Rekombination eine gezielte Rekombinationstechnologie , die zunehmend zur Manipulation der DNA eines Organismus unter kontrollierten Bedingungen in vivo eingesetzt wird . Sie ist analog zur Cre- lox -Rekombination , beinhaltet jedoch die Rekombination von Sequenzen zwischen kurzen Flippase-Erkennungssequenzen ( FRT ) durch die Rekombinase Flippase ( Flp ), die vom 2-µm- Plasmid der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae stammt .

Die minimale FRT-Site-Sequenz von 34 bp hat die folgende Sequenz:

5'GAAGTTCCTATTC tctagaaa GAATAGGAACTTC3'

Die Flippase (Flp) bindet an beide 13 bp langen Arme (5'-GAAGTTCCTATTC-3'), die den 8 bp langen Spacer flankieren, d. h. an die ortsspezifische Rekombinationsregion (Crossover-Region) in umgekehrter Orientierung. Die FRT -vermittelte Spaltung erfolgt unmittelbar vor der asymmetrischen 8 bp langen Kernregion ( 5').tctagaaa3' ) auf dem oberen Strang und dahinter auf dem unteren Strang. [ 1 ] Es existieren mehrere Varianten von FRT- Sequenzen, aber Rekombination kann normalerweise nur zwischen zwei identischen FRT- Sequenzen erfolgen, nicht jedoch zwischen nicht-identischen („heterospezifischen“) FRT- Sequenzen. [ 2 ] [ 3 ]

Biologische Funktion

In Hefe korrigiert dieses Enzym die durch seltene Fehlverteilungsereignisse verursachte Verringerung der Kopienzahl des 2-µm-Plasmids. Es bewirkt dies durch Rekombination zwischen den beiden invertierten Wiederholungen auf dem 2-µm-Plasmid während der DNA-Replikation . Dadurch ändert sich die Richtung einer Replikationsgabel, was zu mehreren Kopierrunden in einem einzigen Replikationsschritt führt. [ 4 ]

Mutationen der FRT-Sequenz

Senecoff et al. (1987) untersuchten, wie Nukleotidsubstitutionen innerhalb der FRT die Effizienz der FLP-vermittelten Rekombination beeinflussen. Die Autoren induzierten Basensubstitutionen an einer oder beiden FRT-Stellen und testeten die FLP-Konzentration, die für ortsspezifische Rekombinationen erforderlich ist. Jede Basensubstitution wurde an jedem der dreizehn Nukleotide innerhalb der FRT-Stelle durchgeführt (z. B. G zu A, T und C). Zunächst zeigten die Autoren, dass die meisten Mutationen innerhalb der FRT-Sequenz nur minimale Auswirkungen haben, wenn sie nur an einer der beiden Stellen auftreten. Treten Mutationen an beiden Stellen auf, wird die Effizienz von FLP drastisch reduziert. Anschließend lieferten die Autoren Daten darüber, welche Nukleotide für die Bindung von FLP und die Effizienz der ortsspezifischen Rekombination am wichtigsten sind. Wird das erste Nukleotid in beiden FRT-Sequenzen durch Cytosin (G zu C), das dritte Nukleotid durch Thymin (A zu T) oder das siebte Nukleotid durch Adenosin (G zu A) ersetzt, so verringert sich die Effizienz der FLP-vermittelten ortsspezifischen Rekombination um mehr als das Hundertfache. [ 5 ] Eine Basensubstitution eines der genannten Nukleotide in nur einer der FRT-Sequenzen führt hingegen zu einer zehnfachen, zehnfachen bzw. fünffachen Reduktion der Effizienz. [ 5 ]

Basensubstitutionen in den großgeschriebenen Nukleotiden führten zur größten Reduktion der FLP-vermittelten ortsspezifischen Rekombination (Wildtyp x Mutante und Mutante x Mutante):

5'GaAtagGaacttc3' [ 5 ]

Viele verfügbare Konstrukte beinhalten zusätzliche Armsequenzen (5'-GAAGTTCCTATTCC-3') ein Basenpaar vom vorgelagerten Element entfernt und in der gleichen Orientierung:

5'GAAGTTCCTATTC c GAAGTTCCTATTC tctagaaa G t ATAGGAACTTC3'

Dieses Segment ist für die Exzision entbehrlich, aber für die Integration, einschließlich des Rekombinase-vermittelten Kassettenaustauschs , unerlässlich . [ 6 ]

Da die Rekombinationsaktivität gezielt auf ein bestimmtes Organ gesteuert oder durch eine geringe Rekombinationsaktivität die DNA nur einer Teilmenge von Zellen konsistent verändert werden kann, eignet sich Flp- FRT zur Erzeugung genetischer Mosaike in vielzelligen Organismen. Mithilfe dieser Technologie lässt sich der Verlust oder die Veränderung eines Gens in einem bestimmten Zielorgan untersuchen, selbst wenn Versuchstiere den Verlust dieses Gens in anderen Organen nicht überleben würden ( räumliche Kontrolle ). Die Auswirkungen einer Genveränderung können auch im Zeitverlauf untersucht werden, indem ein induzierbarer Promotor die Rekombinationsaktivität erst spät in der Entwicklung auslöst ( zeitliche Kontrolle ) – dies verhindert die Veränderung.

Biochemische Struktur von Flp und Wirkungsmechanismus

Biochemisch relevante Struktur und aktives Zentrum

Das Flp-Protein ist, ähnlich wie Cre, eine Tyrosin-spezifische Rekombinase. [ 7 ] Diese Rekombinasefamilie katalysiert die Rekombination zweier DNA-Stränge über einen Typ-IB-Topoisomerase-Mechanismus. [ 7 ] Die Rekombination erfolgt in zwei Schritten. Im ersten Schritt entsteht ein Holliday-Junction -Intermediat. Im zweiten Schritt werden die beiden komplementären Stränge rekombiniert. Wie der Familienname bereits andeutet, spaltet ein hochkonserviertes Tyrosin- Nukleophil die DNA-Stränge. [ 7 ] Die nukleophilen Eigenschaften des Tyrosins greifen das 3'-Phosphat an der Spaltstelle der DNA an und binden daran. [ 7 ] Die entstehende 5'-Hydroxylgruppe der gespaltenen DNA fungiert als Nukleophil und greift das 3'-Phosphat des komplementär gespaltenen DNA-Strangs an, was zur erfolgreichen Rekombination führt. [ 7 ] Außerhalb des Tyrosinrests befindet sich eine konservierte katalytische Pentade. Diese Pentade besteht aus einem Lysin (Lysβ), zwei Argininen (Arg I und II), einem Histidin (His-II) und einem Histidin/Tryptophan (His/Trp-III). Sie bildet eine obligatorische und hochkonservierte Konstellation von Resten für das aktive Zentrum von Flp und Cre (sowie anderer IB-Topoisomerasen). [ 7 ] Diese anderen Reste sind entscheidend für die korrekte Orientierung der Flp-Bindung und -Positionierung auf den DNA-Strängen.

Anwendung der FLP-vermittelten ortsspezifischen Rekombination

Anfangsprobleme

Thermolabilität

Die erste Anwendung der FLP-FRT-Rekombinase in Säugetieren war nicht erfolgreich. Das FLP-Protein war thermolabil (denaturierte bei erhöhten Temperaturen) und daher aufgrund der hohen Körpertemperaturen dieser Tiermodelle ungeeignet. Aufgrund von Patenten und Einschränkungen bei der Verwendung der Cre-Lox-Rekombination bestand jedoch großes Interesse an der Entwicklung einer thermostabileren FLP-FRT-Kassette. Erste Ergebnisse erzielten Buchholz et al. (1997) durch zyklische Mutagenese in Escherichia coli . In ihrer Studie transfizierten die Autoren E. coli- Zellen mit zwei Plasmiden: eines kodierte für zufällig mutierte FLP-Proteine ​​unter der Kontrolle eines Arabinose-Promotors, das andere enthielt einen lacZ-Genpromotor innerhalb einer FRT-Kassette. Die E. coli-Zellen wurden auf Arabinose-Agarplatten bei 37 °C und 40 °C kultiviert. Im Falle einer Rekombination war die lacZ-Expression abgeschwächt, und die Kolonien erschienen weiß. Weiße Kolonien wurden aus jeder Generation ausgewählt und acht Generationen lang auf neuen Arabinose-Agarplatten bei den gleichen Temperaturen kultiviert. [ 8 ] Nachdem die Rekombination mittels Western Blot bestätigt und die mutierten FLP-Gene sequenziert worden waren, wurde dieses FLP- Protein der achten Generation (FLPe) in eine Säugetierzellkultur transfiziert und die Rekombination in den Säugetierzellen bestätigt. [ 8 ] Diese FLP-Variante weist lediglich vier Aminosäuresubstitutionen auf: P2S, L33S, Y108N und S294P.

Entstehung genetischer Mosaike

Genetisches Mosaik entsteht innerhalb eines Organismus, wenn ähnliche Zelltypen aufgrund unterschiedlicher Genotypen an bestimmten Genorten verschiedene Phänotypen aufweisen. Vereinfacht gesagt, tritt dies auf, wenn ein Organismus verschiedene Genotypen besitzt, was in der Natur normalerweise selten vorkommt. Mithilfe der FLP-FRT-Rekombination lässt sich dies jedoch leicht (und problematisch) erzeugen. Sind zwei verschiedene FRT-Sequenzen in einer Zelle vorhanden und liegt FLP in ausreichender Konzentration vor, wird die FRT-Kassette fortlaufend ausgeschnitten und zwischen die beiden FRT-Sequenzen eingefügt. Dieser Prozess setzt sich fort, bis die FLP-Proteinkonzentration unter den erforderlichen Wert sinkt, was dazu führt, dass Zellen innerhalb eines Organismus unterschiedliche Genotypen aufweisen. [ 9 ] Dieses Phänomen wurde von Fruchtfliegen bis hin zu Mäusen beobachtet und betrifft sowohl bestimmte Chromosomen (somatische und Geschlechtschromosomen) als auch Zelltypen (somatische und Keimbahnzellen). [ 9 ] [ 10 ]

Bestimmung der Zelllinien

Vor der Veröffentlichung von Dymecki et al . (1998) wurde die Cre-Rekombinase zur Kartierung des Zellschicksals neuronaler Vorläuferzellen in Mäusen unter Verwendung des En2- Promotors eingesetzt. [ 11 ] Daher vermuteten die Autoren von Dymecki et al . (1998), dass die FLP-Rekombinase in ähnlicher Weise und mit vergleichbarer Effizienz wie die Cre-Rekombinase in Mäusen verwendet werden könnte. Sie erzeugten zwei transgene Mauslinien: eine neuronale Wnt1::Flp-Fusionslinie und eine Linie mit der FRT-Kassette, die das 18. Exon von tm1Cwr flankiert . [ 9 ] Dieses Exon wurde für die Exzision ausgewählt, da seine Entfernung zu einem Nullphänotyp führt. Die beiden Linien wurden verpaart, und die Nachkommen wurden bis zum Erwachsenenalter aufgezogen, bevor sie getötet wurden. Die RNA-Extraktion erfolgte aus neuronalem, muskulärem, enterischem und Schwanzgewebe. Reverse-Transkriptions-PCR und Northern Blotting bestätigten die Exzision des 18. Exons von tm1Cwr im Hirngewebe in hohem Maße und im Muskelgewebe in geringerem Maße (aufgrund von Schwann-Zellen im Muskel). Wie erwartet, wurde in anderen Geweben keine Exzision beobachtet. Die Autoren stellten fest, dass die FLP-Rekombinase bei der Bestimmung des Zellschicksals eine gleichwertige, wenn nicht sogar höhere Effizienz aufwies als die Cre-Rekombinase.

Bei Drosophila melanogaster (Fruchtfliege)

Bislang wurde die Flp-Rekombinase in Drosophila melanogaster vielfach eingesetzt. Ein Vergleich der Flp-Rekombinase mit der Cre-Rekombinase in D. melanogaster wurde von Frickenhaus et al. (2015) veröffentlicht [ 12 ] . Die Autoren von Frickenhaus et al. (2015) verfolgten zwei Ziele: die Charakterisierung und den Vergleich der Wirksamkeit des Flp-Rekombinase-Knockouts mit dem Cre-Rekombinase-Knockout und dem RNAi-Knockdown sowie die Aufklärung der Funktion von cabeza (caz), dem Drosophila-Ortholog von FUS , in den Neuronen und im Muskelgewebe von D. melanogaster . FUS spielt eine wichtige Rolle bei amyotropher Lateralsklerose (ALS) und frontotemporaler Demenz beim Menschen [ 12 ] . Die Autoren verwendeten ein elav - Gal4/UAS -Flp- oder Cre-System, um die Rekombinase spezifisch in Neuronen zu exprimieren, und ein Mef2 -Gal4/UAS-Flp- oder Cre-System, um sie spezifisch in Muskeln zu exprimieren. [ 12 ] Die Autoren schlussfolgern, dass das Flp-Rekombinase-„Knockout“-Werkzeug effektiver ist als RNAi und Cre-Rekombinase, um spezifische Gene in spezifischen Geweben oder Zelllinien auszuschalten, da die bei Cre-Protein und RNAi-Transkript beobachtete Leckexpression ausbleibt. Außerdem beobachteten die Autoren eine Toxizität des Cre-Proteins, die beim Flp-Protein nicht auftritt. [ 12 ]

Bei Danio rerio (Zebrabärbling)

Die Wirksamkeit des FLPe-Rekombinasesystems wurde von Wong et al. (2009) an Zebrafischen untersucht. [ 13 ] Embryonen, die hemizygot für ein FRT-flankiertes, verstärktes grünes Fluoreszenzprotein (EGFP) unter der Kontrolle eines muskelspezifischen Promotors waren, wurden mit dem FLPe-Protein injiziert. Ohne FLPe sollten diese Embryonen EGFP im gesamten Muskelgewebe exprimieren, und nach Kreuzung mit einem Wildtyp-Stamm sollten 50 % der Nachkommen ebenfalls EGFP im Muskelgewebe exprimieren. Embryonen, denen FLPe injiziert wurde, zeigten eine signifikant reduzierte EGFP-Expression im Muskelgewebe, und es wurde auch Mosaizismus beobachtet. [ 13 ] Als diese Embryonen das Erwachsenenalter erreichten, wurden sie mit einem Wildtyp-Stamm verpaart, und die resultierenden Gelege enthielten signifikant weniger Nachkommen, die EGFP im Muskelgewebe exprimierten (0–4 %). [ 13 ] Diese Ergebnisse zeigen, dass FLPe nicht nur in somatischen Zellen hochwirksam ist, sondern auch in der Keimbahn von Zebrafischen.

Bei Pflanzen

Erzeugung von "Phytosensoren" oder "Wächterzellen" in Arabidopsis thaliana und Tabak

Phytosensoren sind gentechnisch veränderte Pflanzen, die biotische oder abiotische Schadstoffe nachweisen können. [ 14 ] Die Herstellung dieser Pflanzen birgt großes Potenzial für Landwirtschaft und Forschung. Die Entwicklung geeigneter Reportervektoren erweist sich jedoch als problematisch. Cis -regulatorische Elemente spielen eine wichtige Rolle bei der Transkriptionsaktivierung von Genen in Pflanzen, und viele dieser Elemente sind noch nicht vollständig erforscht. Viele Phytosensoren exprimieren ihre Reportergene entweder zu schwach oder liefern aufgrund synthetischer Promotoren falsch-positive Ergebnisse. [ 14 ] Rao et al. (2010) nutzten die FLP-Rekombinase zur Herstellung hocheffizienter Phytosensoren. Sie verwendeten einen Hitzeschock-Promotor, um die FLP-Produktion zu induzieren, während ein FRT-flankierter Vektor den CaMV-35S-Promotor vom β-Glucuronidase-Gen (GUS) trennte. Bei Hitzeschockexposition der Pflanzen führte die FLP-Induktion zur Exzision des FRT-flankierten Vektors, wodurch das GUS-Gen direkt stromabwärts des CaMV-35S-Promotors lokalisiert wurde. Die Aktivierung von GUS bewirkte einen Farbumschlag der Blätter von Grün nach Blau; somit meldete der Phytosensor effektiv Stress an das Modellsystem! [ 14 ]

Mit Cre-Rekombinase

Herstellung des gate-ready inducible miRNA (GRIM) Expressionssystems

RNA-Interferenz (RNAi) hat einen Paradigmenwechsel in der Genexpression und im potenziellen Gen-Knockout in Eukaryoten bewirkt. Vor der Entwicklung des GRIM-Expressionssystems war die Herstellung von RNAi-Vektoren aufwändig und zeitintensiv. Die Vektoren wurden mittels der traditionellen Copy-and-Paste-Methode des molekularen Klonens hergestellt. [ 15 ] Garwick-Coppens et al . (2011) entwickelten eine deutlich effizientere Methode zur Herstellung von RNAi-Vektoren, bei der die RNAi-Expression mittels Cre-Rekombinase eingeschleust und mittels Flp-Rekombinase ausgeschaltet werden kann. Das neuartige GRIM-Expressionssystem ermöglicht die wesentlich schnellere Generierung von Expressionsvektoren mit künstlichen RNAi-Konstrukten. [ 15 ] Die Autoren zeigten weiterhin, dass ihr Expressionssystem in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK-Zellen), einer gängigen immortalisierten Zelllinie in der molekularen Forschung, sehr effektiv funktioniert.

Siehe auch

Referenzen

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