Gram-Färbung

Die Gram-Färbung ( auch Gram -Methode genannt ) ist eine Färbemethode zur Einteilung von Bakterienarten in zwei große Gruppen: grampositive und gramnegative Bakterien . Sie kann auch zur Diagnose von Pilzinfektionen eingesetzt werden . ^{[ 1 ]} Der Name leitet sich von dem dänischen Bakteriologen Hans Christian Gram ab , der die Technik 1884 entwickelte. ^{[ 2 ]}

Die Gram-Färbung dient der Unterscheidung von Bakterien anhand der chemischen und physikalischen Eigenschaften ihrer Zellwände . Grampositive Zellen besitzen eine dicke Peptidoglykanschicht in der Zellwand, die den Primärfarbstoff Kristallviolett bindet . Gramnegative Zellen weisen eine dünnere Peptidoglykanschicht auf , die das Auswaschen des Kristallvioletts durch Zugabe von Ethanol ermöglicht . Sie werden durch die Gegenfärbung , üblicherweise Safranin oder Fuchsin , rosa oder rot gefärbt ^{[ 3 ]} . Nach Zugabe von Kristallviolett wird stets Lugolsche Lösung hinzugefügt, um einen stabilen Komplex mit Kristallviolett zu bilden, der die Bindung des Farbstoffs an die Zellwand verstärkt ^{[ 4 ]} .

Die Gram-Färbung ist fast immer der erste Schritt zur Identifizierung einer Bakteriengruppe. Obwohl sie sowohl in der Klinik als auch in der Forschung ein wertvolles Diagnoseinstrument darstellt, lassen sich nicht alle Bakterien mit dieser Methode eindeutig klassifizieren. Dies führt zur Unterscheidung zwischen gramvariablen und gramunbestimmten Gruppen.

Die Methode ist nach ihrem Erfinder, dem dänischen Wissenschaftler Hans Christian Gram (1853–1938), benannt, der sie 1884 während seiner Arbeit mit Carl Friedländer in der Leichenhalle des Berliner Stadtkrankenhauses entwickelte . Gram entwickelte seine Technik nicht, um verschiedene Bakterienarten zu unterscheiden, sondern um Bakterien in gefärbten Lungengewebeschnitten besser sichtbar zu machen. ^{[ 5 ]} Gram bemerkte, dass einige Bakterienzellen eine bemerkenswerte Resistenz gegenüber der Entfärbung aufwiesen. Basierend auf diesen Beobachtungen entwickelte Gram das erste Gram-Färbeverfahren, bei dem er zunächst Ehrlichs Anilin-Gentianaviolett , Lugolsche Lösung , absoluten Alkohol zur Entfärbung und Bismarckbraun zur Gegenfärbung verwendete. ^{[ 6 ]} Er veröffentlichte seine Methode 1884 und erwähnte in seinem kurzen Bericht, dass der Typhus- Erreger die Farbe nicht annahm. ^{[ 7 ]} Gram unterschied mit seinem Verfahren zunächst nicht zwischen gramnegativen und grampositiven Bakterien. ^{[ 6 ]}

Die Gram-Färbung ist eine bakteriologische Labormethode ^{[ 8 ]} , mit der Bakterienarten anhand der physikalischen Eigenschaften ihrer Zellwände in zwei große Gruppen (grampositiv und gramnegativ) unterteilt werden [ 9 ] . Sie kann auch ^{zur Diagnose von} Pilzinfektionen eingesetzt werden [ ^{1 ] .} Archaeen werden nicht mittels Gram-Färbung klassifiziert , da diese Mikroorganismen sehr unterschiedliche Reaktionen zeigen, die nicht mit ihren phylogenetischen Gruppen übereinstimmen ^{[ 10 ]} .

Gram-Färbungen werden an Körperflüssigkeiten oder Biopsien durchgeführt, wenn der Verdacht auf eine Infektion besteht. Gram-Färbungen liefern deutlich schneller Ergebnisse als Kulturen und sind besonders wichtig, wenn eine Infektion einen wesentlichen Einfluss auf die Behandlung und Prognose des Patienten hat; Beispiele hierfür sind Liquor bei Meningitis und Synovialflüssigkeit bei septischer Arthritis . ^{[ 11 ] [ 12 ]}

Grampositive Bakterien besitzen eine dicke, netzartige Zellwand aus Peptidoglykan (50–90 % der Zellhülle) und färben sich daher mit Kristallviolett violett an. Gramnegative Bakterien hingegen haben eine dünnere Peptidoglykanschicht (10 % der Zellhülle), nehmen die violette Färbung daher nicht an und werden mit Safranin rosa gegengefärbt. Die Gram-Färbung umfasst vier grundlegende Schritte:

1. Ein hitzefixierter Ausstrich einer Bakterienkultur wird mit einem Primärfarbstoff ( Kristallviolett ) angefärbt. Die Hitzefixierung tötet zwar einige Bakterien ab, dient aber hauptsächlich dazu, die Bakterien auf dem Objektträger zu fixieren, damit sie während des Färbevorgangs nicht ausgespült werden.
2. Die Zugabe von Jod , das an Kristallviolett bindet und es in der Zelle einschließt
3. Schnelle Entfärbung mit Ethanol oder Aceton
4. Gegenfärbung mit Safranin . ^{[ 13 ]} Karbolfuchsin wird manchmal anstelle von Safranin verwendet, da es anaerobe Bakterien intensiver anfärbt, wird aber seltener als Gegenfärbung eingesetzt. ^{[ 14 ]}

Kristallviolett (CV) dissoziiert in wässrigen Lösungen in CV⁺und Chlorid ( Cl⁻) Ionen. Diese Ionen durchdringen die Zellwand sowohl grampositiver als auch gramnegativer Zellen. Die CV⁺Das Ion interagiert mit negativ geladenen Bestandteilen von Bakterienzellen und färbt die Zellen violett. ^{[ 15 ]}

Iodid ( I⁻oder ich⁻ ₃) interagiert mit CV⁺und bildet große Komplexe aus Kristallviolett und Iod (CV–I) in den inneren und äußeren Zellschichten. Iod wird oft als Beizmittel bezeichnet , ist aber ein Fänger, der die Entfernung des CV–I-Komplexes verhindert und somit die Zelle färbt. ^{[ 16 ]}

Bei Zugabe eines Entfärbungsmittels wie Alkohol oder Aceton reagiert dieses mit den Lipiden der Zellmembran. ^{[ 17 ]} Eine gramnegative Zelle verliert ihre äußere Lipopolysaccharidmembran, wodurch die innere Peptidoglykanschicht freiliegt. Die Kristallviolett-I-Komplexe werden zusammen mit der äußeren Membran aus der gramnegativen Zelle ausgewaschen. ^{[ 18 ]} Im Gegensatz dazu dehydriert eine grampositive Zelle durch die Behandlung mit Ethanol. Die großen Kristallviolett-I-Komplexe werden aufgrund der mehrschichtigen Struktur des Peptidoglykans in der grampositiven Zelle eingeschlossen. ^{[ 18 ]} Der Entfärbungsschritt ist entscheidend und muss präzise getimt werden; wird das Entfärbungsmittel zu lange (innerhalb weniger Sekunden) einwirken gelassen, verschwindet die Kristallviolett-Färbung sowohl von grampositiven als auch von gramnegativen Zellen. ^{[ 19 ]}

Nach der Entfärbung bleibt die grampositive Zelle violett, während die gramnegative Zelle ihre violette Farbe verliert. ^{[ 19 ]} Die Gegenfärbung, üblicherweise mit positiv geladenem Safranin oder basischem Fuchsin, wird zuletzt aufgetragen, um den entfärbten gramnegativen Bakterien eine rosa oder rote Farbe zu verleihen. ^{[ 3 ] [ 20 ]} Sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterien nehmen die Gegenfärbung auf. Diese ist jedoch bei grampositiven Bakterien aufgrund der dunkleren Kristallviolettfärbung nicht sichtbar.

Grampositive Bakterien besitzen im Allgemeinen eine einfache Membran ( Monoderm ), die von einem dicken Peptidoglykan umgeben ist. Diese Regel gilt für zwei Stämme: die Bacillota (mit Ausnahme der Klassen Mollicutes und Negativicutes ) und die Actinomycetota . ^{[ 9 ] [ 21 ]} Im Gegensatz dazu sind Mitglieder der Chloroflexota (grüne Nichtschwefelbakterien) Monodermen, besitzen aber ein dünnes oder gar kein Peptidoglykan (Klasse Dehalococcoidetes ) und können negativ, positiv oder unbestimmt gefärbt werden; Mitglieder der Deinococcota färben sich positiv, sind aber Didermen mit einem dicken Peptidoglykan. ^{[ 9 ] [ 21 ]}

Die Festigkeit der Zellwand wird durch Teichonsäuren erhöht, glykopolymere Substanzen, die in das Peptidoglykan eingebettet sind. Teichonsäuren erfüllen vielfältige Funktionen: Sie erzeugen die negative Nettoladung der Zelle, tragen zur Steifigkeit und Formstabilität der Zellwand bei und unterstützen die Zellteilung sowie die Resistenz gegenüber verschiedenen Stressfaktoren wie Hitze und Salz. Trotz der Dichte der Peptidoglykanschicht bleibt diese relativ porös, sodass die meisten Substanzen hindurchtreten können. Für größere Nährstoffe nutzen grampositive Bakterien Exoenzyme, die extrazellulär sezerniert werden, um Makromoleküle außerhalb der Zelle abzubauen. ^{[ 22 ]}

Historisch gesehen bildeten die grampositiven Bakterien den Stamm der Firmicutes , eine Bezeichnung, die heute für die größte Gruppe verwendet wird. Sie umfasst viele bekannte Gattungen wie Lactobacillus, Bacillus , Listeria , Staphylococcus , Streptococcus , Enterococcus und Clostridium . ^{[ 23 ]} Zudem wurde der Stamm um die Mollicutes erweitert, Bakterien wie Mycoplasma und Thermoplasma , denen Zellwände fehlen und die daher nicht gramgefärbt werden können, die aber von grampositiven Bakterien abstammen. ^{[ 24 ]}

Manche Bakterien besitzen Zellwände, die Farbstoffe besonders gut aufnehmen. Diese Bakterien erscheinen in der Gram-Färbung positiv, obwohl sie nicht eng mit anderen grampositiven Bakterien verwandt sind. Man nennt sie säurefeste Bakterien ; sie lassen sich nur durch spezielle Färbeverfahren von anderen grampositiven Bakterien unterscheiden . ^{[ 25 ]}

Gramnegative Bakterien besitzen im Allgemeinen eine dünne Peptidoglykanschicht zwischen zwei Membranen ( Diderm ). ^{[ 26 ]} Lipopolysaccharid (LPS) ist das am häufigsten vorkommende Antigen auf der Zelloberfläche der meisten gramnegativen Bakterien und macht bis zu 80 % der äußeren Membran von E. coli und Salmonella aus . ^{[ 27 ]} Diese LPS-Moleküle, bestehend aus dem O-Antigen bzw. O-Polysaccharid, dem Kernpolysaccharid und Lipid A, erfüllen vielfältige Funktionen. Sie tragen unter anderem zur negativen Ladung der Zelle bei und schützen vor bestimmten Chemikalien. LPS spielt eine entscheidende Rolle bei der Interaktion zwischen Wirt und Pathogen: Das O-Antigen löst eine Immunantwort aus, und Lipid A wirkt als Endotoxin. ^{[ 22 ]}

Darüber hinaus fungiert die äußere Membran als selektive Barriere, die durch Porine reguliert wird – Transmembranproteine, die Poren bilden, durch die spezifische Moleküle hindurchtreten können. Der Raum zwischen Zellmembran und äußerer Membran, das Periplasma, enthält periplasmatische Enzyme zur Nährstoffverarbeitung. Ein wichtiger Strukturbaustein, der die Peptidoglykanschicht mit der äußeren Membran verbindet, ist das Braunsche Lipoprotein, das der bakteriellen Zellwand zusätzliche Stabilität und Festigkeit verleiht. ^{[ 22 ]}

Die meisten Bakterienstämme sind gramnegativ, darunter die Cyanobakterien , die grünen Schwefelbakterien und die meisten Pseudomonadota (Ausnahmen bilden einige Vertreter der Rickettsiales und die Insekten-Endosymbionten der Enterobacteriales ). ^{[ 9 ] [ 21 ]}

Einige Bakterien zeigen nach Gram-Färbung ein gramvariables Muster: Es ist eine Mischung aus rosa und violetten Zellen zu sehen. ^{[ 18 ] [ 28 ]} In Kulturen von Bacillus, Butyrivibrio und Clostridium geht eine Abnahme der Peptidoglykandicke während des Wachstums mit einer Zunahme der Anzahl gramnegativer Zellen einher. ^{[ 28 ]} Darüber hinaus kann bei allen mit der Gram-Färbung gefärbten Bakterien das Alter der Kultur das Färbeergebnis beeinflussen. ^{[ 28 ]}

Gram-unbestimmte Bakterien reagieren nicht vorhersagbar auf die Gram-Färbung und können daher nicht als grampositiv oder gramnegativ bestimmt werden. Beispiele hierfür sind viele Mycobacterium -Arten , darunter Mycobacterium bovis , Mycobacterium leprae und Mycobacterium tuberculosis , wobei die beiden letztgenannten die Erreger von Lepra bzw. Tuberkulose sind. ^{[ 29 ] [ 30 ]} Bakterien der Gattung Mycoplasma besitzen keine Zellwand um ihre Zellmembranen ^{[ 11 ]} , wodurch sie sich mit der Gram-Methode nicht anfärben lassen und resistent gegen Antibiotika sind, die die Zellwandsynthese hemmen. ^{[ 31 ] [ 32 ]}

Der Begriff Gram-Färbung leitet sich vom Nachnamen Hans Christian Gram ab ; das Eponym (Gram) wird daher großgeschrieben, das Substantiv (Färbung) jedoch nicht, wie in wissenschaftlichen Fachbegriffen üblich. ^{[ 33 ]} Die Anfangsbuchstaben von grampositiv und gramnegativ , die eponyme Adjektive sind , können je nach verwendetem Stilhandbuch entweder ein großes G oder ein kleines g sein. Die US-amerikanischen Centers for Disease Control and Prevention (CDC) und andere Stilrichtlinien wie der AMA-Stil verwenden die Kleinschreibung . ^{[ 34 ]} Wörterbücher verwenden mitunter Kleinbuchstaben, ^{[ 35 ] [ 36 ]} Großbuchstaben, ^{[ 37 ] [ 38 ] [ 39 ] [ 40 ]} oder beides. ^{[ 41 ] [ 42 ]} Die Verwendung von Großbuchstaben für grampositiv oder gramnegativ ist auch in vielen wissenschaftlichen Zeitschriftenartikeln und Publikationen üblich. ^{[ 42 ] [ 43 ] [ 44 ]} Bei der Einreichung von Artikeln bei Fachzeitschriften kann die jeweilige Zeitschrift ihren eigenen Stil für die Postprint- Version anwenden oder auch nicht. Preprint- Versionen enthalten den vom Autor gewählten Stil. Selbst Stilrichtlinien, die Kleinbuchstaben für die Adjektive „grampositiv“ und „gramnegativ“ verwenden, schreiben „Gram-Färbung“ in der Regel groß .

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• Video zur Gram-Färbetechnik