Wirtszellproteine ​​( HCPs ) sind prozessbedingte Proteinverunreinigungen, die vom Wirtsorganismus während der Herstellung von Biotherapeutika produziert werden. Im Rahmen der Aufreinigung wird der Großteil der produzierten HCPs aus dem Endprodukt entfernt (>99 % der Verunreinigungen werden entfernt). Dennoch verbleiben Restmengen an HCPs im fertigen Arzneimittel. Beispiele für HCPs, die im gewünschten Arzneimittel verbleiben können, sind monoklonale Antikörper (mAbs), Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs), therapeutische Proteine , Impfstoffe und andere proteinbasierte Biopharmazeutika . [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]

Wirkstoffe können bei Personen Immunreaktionen auslösen oder die Wirksamkeit, Stabilität oder Gesamtwirkung eines Arzneimittels beeinträchtigen. Nationale Zulassungsbehörden wie die FDA und die EMA geben Richtlinien zu zulässigen Wirkstoffkonzentrationen in Arzneimitteln vor, bevor diese für die Öffentlichkeit zugänglich gemacht werden. Die zulässige Wirkstoffkonzentration in einem Endprodukt wird individuell bewertet und hängt von verschiedenen Faktoren ab, darunter Dosis, Häufigkeit der Anwendung, Art des Arzneimittels und Schweregrad der Erkrankung.

Der zulässige Konzentrationsbereich von Wirtsproteinen (HCPs) in einem pharmazeutischen Endprodukt ist aufgrund der Einschränkungen der derzeit verfügbaren Nachweis- und Analysemethoden groß. [ 4 ] Die Analyse von HCPs ist komplex, da das HCP-Gemisch aus einer Vielzahl von Proteinarten besteht , die jeweils spezifisch für den jeweiligen Wirtsorganismus sind und nicht mit dem beabsichtigten rekombinanten Protein verwandt sind . [ 5 ] Die Analyse dieser großen Vielfalt an Proteinarten in sehr geringen Konzentrationen ist schwierig und erfordert hochempfindliche Geräte, die noch nicht vollständig entwickelt sind. Die Überwachung der HCP-Konzentrationen ist aufgrund ihrer unklaren Auswirkungen auf den Körper notwendig. Bereits in Spurenmengen sind die Auswirkungen von HCPs auf Patienten unbekannt, und bestimmte HCPs können die Proteinstabilität und die Wirksamkeit des Arzneimittels beeinträchtigen oder Immunogenität hervorrufen . [ 6 ] [ 7 ] Wird die Stabilität des Arzneimittels beeinträchtigt, kann die Haltbarkeit des Wirkstoffs im pharmazeutischen Produkt abnehmen. Auch die beabsichtigten Wirkungen des Arzneimittels auf die Patienten können verstärkt oder abgeschwächt werden, was zu gesundheitlichen Komplikationen führen kann. Der Grad der Immunogenität ist langfristig schwer, wenn nicht gar unmöglich, zu bestimmen, und die Folgen können schwerwiegende Gefährdungen der Gesundheit des Patienten umfassen. [ 5 ]

Sicherheitsrisiko

Wirtszellproteine ​​(HCPs) in biopharmazeutischen Produkten stellen ein potenzielles Sicherheitsrisiko für den Menschen dar, da sie fremde Proteine ​​und Biomoleküle in das menschliche Immunsystem einbringen . Da häufig E. coli [ 8 ] , Hefe [ 9 ] , die Maus-Myelomzelllinie NS0 [ 10 ] und CHO- Zellen [ 11 ] als Wirtszellen für die Herstellung biopharmazeutischer Arzneimittel verwendet werden , unterscheiden sich die resultierenden HCPs genetisch von den Proteinen, die der menschliche Körper erkennt [ 12 ] . Infolgedessen kann die Anwesenheit von HCPs im menschlichen Körper eine Immunantwort auslösen, die möglicherweise zu schwerwiegenden gesundheitlichen Problemen führen kann.

Es besteht ein Zusammenhang zwischen der Menge an Fremdantigenen ( HPCs) im Körper und der Stärke der Immunantwort . Je mehr HCPs in einem Arzneimittel vorhanden sind, desto stärker wird die Immunantwort aktiviert. Mehrere Studien haben einen Zusammenhang zwischen einer Reduktion von HCPs und einem Rückgang spezifischer entzündungsfördernder Zytokine festgestellt . [ 5 ] Andere HCPs können einem menschlichen Protein sehr ähnlich sein und eine Immunantwort mit Kreuzreaktivität gegen das menschliche Protein oder das Protein des Arzneimittels auslösen. Die genauen Auswirkungen von HCPs auf den einzelnen Patienten sind unklar und mit den derzeit in der biopharmazeutischen Produktion und Analyse verwendeten Analysemethoden schwer zu bestimmen. [ 5 ]

Analyse

HCPs werden während der Herstellung von Biopharmazeutika im Rahmen des Qualitätskontrollprozesses identifiziert. [ 5 ]

Während des Produktionsprozesses beeinflussen verschiedene Faktoren, darunter die Gene der Wirtszelle, die Art der Produktexpression und die Reinigungsschritte, die endgültige Zusammensetzung und Menge der Wirtszellproteine ​​(HCPs). [ 5 ] Mehrere Studien berichten, dass HCPs häufig zusammen mit dem Produkt selbst durch Interaktion mit dem rekombinanten Protein ko-aufgereinigt werden. [ 6 ]

Der Enzymimmunoassay ( ELISA ) ist aufgrund seiner hohen Proteinsensitivität die vorherrschende Methode zur Wirtzellprotein-Analyse (HCP) in pharmazeutischen Produkten. Er ermöglicht den Nachweis geringer HCP-Konzentrationen in den hergestellten Arzneimitteln. [ 4 ] Obwohl der Entwicklungsprozess einen längeren Arbeitsaufwand und mehrere Tierversuche erfordert, lässt sich die HCP-Gehaltsanalyse im Endprodukt schnell durchführen und auswerten. [ 1 ] Trotz der hohen Sensitivität des ELISA für die HCP-Analyse weist das Verfahren einige Einschränkungen auf. Die HCP-Quantifizierung basiert hauptsächlich auf der Menge und Affinität der Anti-HCP- Antikörper zum Nachweis der HCP- Antigene . Anti-HCP-Antikörperpools können nicht die gesamte HCP-Population abdecken, und schwach immunogene Proteine ​​lassen sich nicht nachweisen, da im Prozess keine entsprechenden Antikörper gebildet werden. [ 4 ]

Darüber hinaus wurden Methoden wie die Kombination von Massenspektrometrie (MS) und Flüssigkeitschromatographie ( LC-MS ) entwickelt, um eine effizientere und effektivere Analyse und Reinigung von Wirtzellproteinen (HCP) zu ermöglichen. Diese Methoden sind in der Lage:

  • Unterschiedliche Proteinkonzentrationen in einer komplexen Probe nachweisen
  • Verfolgen Sie eine sich ständig verändernde HCP-Population und deren Konzentrationen während eines Herstellungsprozesses
  • Analysiere viele Proteine ​​gleichzeitig
  • Messung von HCPs mit geringer Häufigkeit, die vom Zielproteinprodukt mit hoher Häufigkeit überlagert werden [ 6 ].
  • Charakterisierung der HCP-ELISA-Reagenzien, einschließlich der Antikörper und des zugehörigen Kit-Standards [ 13 ].

Kürzlich wurde die MS-Methode durch die SWATH-LC-MS-Methode weiter verbessert. SWATH ist eine datenunabhängige Akquisitionsmethode (DIA) der Massenspektrometrie, bei der der Massenbereich in kleine Massenfenster unterteilt und anschließend mit Tandem-MS ( MS/MS ) analysiert wird. Die wichtigsten Vorteile sind die Reproduzierbarkeit sowohl für die Identifizierung einzelner HCPs als auch für die absolute Quantifizierung durch Verwendung interner Proteinstandards. [ 14 ]

Trotz der deutlichen Verbesserungen dieser Methode zur Proteinanalyse bestehen auch Einschränkungen. Die wichtigste davon ist, dass für die Durchführung der Analyse ein hohes Maß an Fachwissen und hochentwickelte Instrumente erforderlich sind. [ 13 ]

Siehe auch

Referenzen

  1. ^ a b „Verfolgung von Wirtszellproteinen während der biopharmazeutischen Herstellung: Fortschrittliche Methoden zur Sicherstellung hoher Produktqualität“ . www.americanpharmaceuticalreview.com . Abgerufen am 2. Oktober 2018 .
  2. ^ Goey CH, Alhuthali S, Kontoravdi C (2018). „Entfernung von Wirtszellproteinen aus biopharmazeutischen Präparaten: Auf dem Weg zur Umsetzung von Qualität durch Design“. Biotechnology Advances . 36 (4): 1223–1237 . doi : 10.1016/j.biotechadv.2018.03.021 . hdl : 10044/1/85952 . PMID 29654903. S2CID 4870812 .  
  3. ^ Dimitrov DS (2012). „Therapeutische Proteine“. Methoden der Molekularbiologie . Band 899. S.  1–26 . doi : 10.1007/978-1-61779-921-1_1 . ISBN 978-1-61779-920-4ISSN  1940-6029 . PMC  6988726 . PMID  22735943 .​
  4. Zhu - Shimoni J, Yu C, Nishihara J, Wong RM, Gunawan F, Lin M, et al. (Dezember 2014). „Testung von Wirtszellproteinen mittels ELISA und Anwendung orthogonaler Methoden“ . Biotechnology and Bioengineering . 111 (12): 2367–2379 . doi : 10.1002/bit.25327 . PMID 24995961. S2CID 23923786 .  
  5. ^ a b c d e f Wang X, Hunter AK, Mozier NM (Juni 2009). „Wirtszellproteine ​​in der Entwicklung von Biologika: Identifizierung, Quantifizierung und Risikobewertung“ . Biotechnology and Bioengineering . 103 (3): 446–458 . doi : 10.1002/bit.22304 . PMID 19388135. S2CID 22707536 .  
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  13. Pilely K, Johansen MR, Lund RR, Kofoed T, Jørgensen TK, Skriver L, et al. (Januar 2022). „Überwachung prozessbedingter Verunreinigungen in Biologika – Analyse von Wirtszellproteinen“ . Analytical and Bioanalytical Chemistry . 414 (2): 747–758 . doi : 10.1007/ s00216-021-03648-2 . PMC 8483941. PMID 34595561 .  
  14. ^ Heissel S, Bunkenborg J, Kristiansen MP, Holmbjerg AF, Grimstrup M, Mørtz E, et al. (Juli 2018). „Evaluation von Spektralbibliotheken und Probenvorbereitung für die DIA-LC-MS-Analyse von Wirtszellproteinen: Eine Fallstudie eines bakteriell exprimierten rekombinanten biopharmazeutischen Proteins“ ( PDF) . Protein Expression and Purification . 147 : 69–77 . doi : 10.1016/j.pep.2018.03.002 . PMID 29526817. S2CID 4741772 .