Die Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie ( LC-MS ) ist eine analytische Technik, die die physikalischen Trenneigenschaften der Flüssigkeitschromatographie (oder HPLC ) mit den massenanalytischen Möglichkeiten der Massenspektrometrie (MS) kombiniert. Gekoppelte Chromatographie-MS-Systeme sind in der chemischen Analytik weit verbreitet, da sich die jeweiligen Stärken beider Techniken synergistisch verstärken. Während die Flüssigkeitschromatographie Gemische mit mehreren Komponenten trennt, liefert die Massenspektrometrie Spektralinformationen, die zur Identifizierung (oder Bestätigung der vermuteten Identität) der einzelnen Komponenten beitragen können. [ 1 ] Die MS ist nicht nur sensitiv, sondern ermöglicht auch die selektive Detektion, wodurch eine vollständige chromatographische Trennung entfällt. [ 2 ] LC-MS eignet sich aufgrund ihrer guten Abdeckung eines breiten Spektrums an chemischen Substanzen auch für die Metabolomik . [ 3 ] Diese Tandemtechnik kann zur Analyse biochemischer, organischer und anorganischer Verbindungen eingesetzt werden, die häufig in komplexen Proben umwelt- und biologischen Ursprungs vorkommen. Daher kann LC-MS in einer Vielzahl von Sektoren eingesetzt werden, darunter Biotechnologie , Umweltüberwachung, Lebensmittelverarbeitung sowie die pharmazeutische , agrochemische und kosmetische Industrie. [ 4 ] [ 5 ] Seit Anfang der 2000er Jahre wird LC-MS (genauer: LC- MS/MS ) [ 6 ] auch in klinischen Anwendungen eingesetzt. [ 7 ]

Neben den Geräten für die Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie enthält ein LC-MS-System eine Schnittstelle, die die getrennten Komponenten effizient von der LC-Säule in die Ionenquelle des Massenspektrometers überführt. [ 5 ] [ 8 ] Diese Schnittstelle ist notwendig, da LC- und Massenspektrometer grundsätzlich inkompatibel sind. Während die mobile Phase in einem LC-System eine unter Druck stehende Flüssigkeit ist, arbeiten Massenspektrometer üblicherweise unter Hochvakuum. Daher ist es nicht möglich, das Eluat direkt von der LC-Säule in die Ionenquelle des Massenspektrometers zu pumpen. Insgesamt ist die Schnittstelle ein mechanisch einfacher Bestandteil des LC-MS-Systems, der die maximale Menge an Analyt überträgt , einen signifikanten Anteil der in der LC verwendeten mobilen Phase entfernt und die chemische Identität der Chromatographieprodukte erhält ( chemische Inertheit ). Die Schnittstelle darf die Ionisierungseffizienz und die Vakuumbedingungen des Massenspektrometers nicht beeinträchtigen . [ 5 ] Heutzutage basieren die meisten weit verbreiteten LC-MS-Schnittstellen auf Ionisationsverfahren bei Atmosphärendruck (API) wie Elektrospray-Ionisation (ESI), chemischer Ionisation bei Atmosphärendruck (APCI) und Photoionisation bei Atmosphärendruck (APPI). Diese Schnittstellen wurden in den 1990er Jahren nach einem zwei Jahrzehnte währenden Forschungs- und Entwicklungsprozess verfügbar. [ 9 ] [ 8 ]

Geschichte

Die Kopplung von Chromatographie und Massenspektrometrie (MS) ist eine etablierte Strategie der chemischen Analyse, die bis in die 1950er Jahre zurückreicht. Die Gaschromatographie (GC)-MS wurde ursprünglich 1952 eingeführt, als A. T. James und A. J. P. Martin Tandem-Trenn-Massenspektrometrie-Verfahren entwickelten. [ 10 ] In der GC werden die Analyten als Gas von der Trennsäule eluiert, und die Anbindung an Elektronenstoßionisations- ( EI ) oder chemische Ionisationsquellen ( CI ) im MS-System stellte eine technisch einfachere Herausforderung dar. Daher verlief die Entwicklung von GC-MS-Systemen schneller als die von LC-MS, und erste kommerzielle Systeme dieser Art kamen in den 1970er Jahren auf den Markt. [ 8 ] Die Entwicklung von LC-MS-Systemen dauerte länger als die von GC-MS und hing direkt mit der Entwicklung geeigneter Schnittstellen zusammen. Victor Talrose und seine Mitarbeiter in Russland begannen Ende der 1960er Jahre mit der Entwicklung der LC-MS [ 11 , 12 ] , indem sie erstmals Kapillaren zur Verbindung einer LC-Säule mit einer EI-Quelle verwendeten [ 13 , 9 ] . Eine ähnliche Strategie wurde 1973 von McLafferty und Mitarbeitern untersucht, die die LC-Säule mit einer CI-Quelle koppelten [14], wodurch ein höherer Flüssigkeitsfluss in die Quelle ermöglicht wurde. Dies war die erste und naheliegendste Methode zur Kopplung von LC mit MS und wurde als Kapillareinlassschnittstelle bekannt. Diese Pionierschnittstelle für LC-MS bot die gleichen Analysemöglichkeiten wie GC-MS , war jedoch auf relativ flüchtige Analyten und unpolare Verbindungen mit niedriger Molekülmasse (unter 400 Da) beschränkt. Bei der Kapillareinlassschnittstelle war die Verdunstung der mobilen Phase innerhalb der Kapillare eines der Hauptprobleme. In den ersten Entwicklungsjahren der LC-MS wurden Online- und Offline-Kopplungsverfahren vorgeschlagen. Die Offline-Kopplung umfasste im Allgemeinen die Fraktionssammlung, die Verdampfung des Lösungsmittels und den Transfer der Analyten zum Massenspektrometer mittels Sonden. Die Offline-Probenaufbereitung war zeitaufwändig und barg ein inhärentes Risiko der Probenkontamination. Schnell wurde erkannt, dass die Analyse komplexer Gemische die Entwicklung einer vollautomatisierten Online-Kopplungslösung in der LC-MS erforderte. [ 9 ]

Der Schlüssel zum Erfolg und zur breiten Anwendung der LC-MS als Routineanalysemethode liegt in der Schnittstelle und der Ionenquelle zwischen der flüssigkeitsbasierten LC und der Vakuum-MS. Die folgenden Schnittstellen waren Vorstufen auf dem Weg zu den modernen Atmosphärendruck-Ionisationsschnittstellen und werden aus historischem Interesse beschrieben.

Schnittstelle zum Förderband

Die Moving-Belt-Schnittstelle (MBI) wurde 1977 von McFadden et al. entwickelt und von Finnigan kommerzialisiert. [ 15 ] Diese Schnittstelle bestand aus einem endlosen Förderband, auf das das Eluat der LC-Säule bandförmig aufgetragen wurde. Auf dem Band wurde das Lösungsmittel durch sanftes Erhitzen und effizientes Absaugen der Lösungsmitteldämpfe unter reduziertem Druck in zwei Vakuumkammern verdampft. Nach Entfernung der flüssigen Phase lief das Band über eine Heizplatte, die die Analyten schlagartig in die Ionenquelle des Massenspektrometers desorbierte. Einer der wesentlichen Vorteile der MBI war ihre Kompatibilität mit einer Vielzahl chromatographischer Bedingungen. [ 9 ] Die MBI wurde zwischen 1978 und 1990 erfolgreich für LC-MS-Anwendungen eingesetzt, da sie die Kopplung von LC an MS-Geräte mit EI-, CI- und FAB -Ionenquellen ermöglichte . Die gängigsten MS-Systeme, die über MBI-Schnittstellen mit LC-Säulen verbunden wurden, waren Magnetsektor- und Quadrupol- Massenspektrometer. MBI-Schnittstellen für LC-MS ermöglichten die breite Anwendung der MS in der Analyse von Arzneimitteln, Pestiziden, Steroiden, Alkaloiden und polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen . Diese Schnittstelle wird aufgrund ihrer komplexen Mechanik, der Schwierigkeiten beim Bandwechsel (bzw. der Reinigung) sowie ihrer Unfähigkeit, sehr labile Biomoleküle zu analysieren, nicht mehr verwendet.

Direkte Flüssigkeitseinführungsschnittstelle

Die Direct Liquid Introduction (DLI)-Schnittstelle wurde 1980 entwickelt. Sie sollte das Problem der Flüssigkeitsverdunstung im Kapillareinlass lösen. Bei der DLI wird ein kleiner Teil des LC-Flusses durch eine kleine Öffnung oder ein Diaphragma (typischerweise 10 μm Durchmesser) gepresst, um einen Flüssigkeitsstrahl aus kleinen Tröpfchen zu erzeugen, die anschließend in einer Desolvatisierungskammer getrocknet werden. [ 12 ] Die Analyten werden mittels lösungsmittelgestützter chemischer Ionisation ionisiert, wobei die LC-Lösungsmittel als Reagenzgase dienen. Für die Verwendung dieser Schnittstelle war es notwendig, den aus der LC-Säule austretenden Fluss aufzuteilen, da nur ein kleiner Teil des Eluats (10 bis 50 μl/min von 1 ml/min) in die Quelle eingeleitet werden konnte, ohne den Vakuumdruck des MS-Systems zu stark zu erhöhen. Alternativ erzielte Henion an der Cornell University Erfolge mit Mikrobohrungs-LC-Methoden, sodass der gesamte (niedrige) LC-Fluss genutzt werden konnte. Eines der Hauptprobleme der DLI-Schnittstelle war die häufige Verstopfung der Membranöffnungen. Die DLI-Schnittstelle wurde zwischen 1982 und 1985 zur Analyse von Pestiziden, Kortikosteroiden, Metaboliten in Pferdeurin, Erythromycin und Vitamin B12 eingesetzt . Sie wurde jedoch durch die Thermospray- Schnittstelle ersetzt, wodurch die Durchflussbeschränkungen und die Probleme mit den verstopften Membranen beseitigt wurden. [ 5 ] [ 9 ]

Ein verwandtes Gerät war die Partikelstrahlschnittstelle (PBI), die 1984 von Willoughby und Browner entwickelt wurde. [ 16 ] Partikelstrahlschnittstellen lösten 1988 die MBI in der LC-MS-Technologie ab. [ 9 ] [ 17 ] Die PBI funktionierte, indem sie das Elutionsmittel mithilfe eines Helium-Zerstäubers in das Vakuum sprühte, die Tröpfchen trocknete und den Lösungsmitteldampf (mittels Strahlseparator) absaugte, während der Strom monodisperser, getrockneter Partikel mit dem Analyten in die Ionenquelle strömte. [ 12 ] Durch das Trocknen der Tröpfchen außerhalb des Quellenvolumens und das Absaugnen des Lösungsmitteldampfes mittels Strahlseparator konnten die Partikel in eine Niederdruck-EI-Quelle eintreten und dort verdampft werden. Wie bei der MBI war die Möglichkeit, bibliotheksdurchsuchbare EI-Spektren zu erzeugen, ein deutlicher Vorteil für viele Anwendungen. Das von Hewlett Packard und später von VG und Extrel kommerzialisierte Verfahren erzielte mäßige Erfolge, wurde aber weitgehend durch Atmosphärendruck-Schnittstellen wie Elektrospray und APCI verdrängt, die ein breiteres Spektrum an Compound-Abdeckung und Anwendungen ermöglichen.

Thermospray-Schnittstelle

Die Thermospray- Schnittstelle (TSP) wurde 1980 von Marvin Vestal und Mitarbeitern an der Universität Houston entwickelt. [ 18 ] Sie wurde von Vestec und mehreren führenden Massenspektrometerherstellern kommerzialisiert. Die Schnittstelle entstand aus einem Langzeitforschungsprojekt mit dem Ziel, eine LC-MS-Schnittstelle zu finden, die hohe Flussraten (1 ml/min) ermöglicht und die Flussaufteilung von DLI-Schnittstellen vermeidet. Die TSP-Schnittstelle bestand aus einer beheizten Sonde, einer Desolvatisierungskammer und einem Ionenfokussierungsskimmer. Das LC-Eluat durchströmte die beheizte Sonde und trat als Strahl aus Dampf und kleinen Tröpfchen bei niedrigem Druck in die Desolvatisierungskammer aus. Anfänglich wurde die Schnittstelle mit einem Glühfaden oder einer Entladung als Ionenquelle betrieben (wodurch sie als CI-Quelle für verdampftes Analytenmaterial diente). Bald stellte sich jedoch heraus, dass auch bei abgeschaltetem Glühfaden oder abgeschalteter Entladung Ionen beobachtet wurden. Dies könnte entweder auf die direkte Emission von Ionen aus den Flüssigkeitströpfchen während deren Verdunstung in einem Prozess im Zusammenhang mit Elektrospray-Ionisation oder Ionenverdampfung oder auf die chemische Ionisation verdampfter Analytmoleküle aus Pufferionen (wie z. B. Ammoniumacetat) zurückzuführen sein. Die Beobachtung mehrfach geladener Ionen bei einigen größeren Analyten deutet darauf hin, dass unter bestimmten Bedingungen eine direkte Analytionenemission stattfand. [ 12 ] Die Schnittstelle konnte bis zu 2 ml/min Eluat von der LC-Säule verarbeiten und effizient in das MS-Vakuumsystem einleiten. TSP eignete sich zudem besser für LC-MS-Anwendungen mit Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (RT-LC). Im Laufe der Zeit wurde die mechanische Komplexität von TSP reduziert, und diese Schnittstelle etablierte sich als erste ideale LC-MS-Schnittstelle für pharmazeutische Anwendungen, einschließlich der Analyse von Arzneimitteln , Metaboliten, Konjugaten, Nukleosiden , Peptiden , Naturstoffen und Pestiziden . Die Einführung der TSP-Schnittstelle stellte eine bedeutende Verbesserung für LC-MS-Systeme dar und war bis Anfang der 1990er-Jahre die am weitesten verbreitete Schnittstelle, bevor sie allmählich durch Schnittstellen mit Atmosphärendruckionisation (API) ersetzt wurde. [ 5 ] [ 8 ] [ 17 ]

FAB-basierte Schnittstellen

Die ersten Fast-Atom-Bombardment- ( FAB ) und Continuous-Flow-FAB-Schnittstellen (CF-FAB) wurden 1985 bzw. 1986 entwickelt. [ 17 ] Beide Schnittstellen waren ähnlich, unterschieden sich jedoch darin, dass die FAB eine poröse Fritte als Verbindungskanal nutzte, während die CF-FAB eine Sondenspitze verwendete. Die CF-FAB erwies sich als erfolgreichere LC-MS-Schnittstelle und eignete sich zur Analyse nichtflüchtiger und thermisch labiler Verbindungen. Bei diesen Schnittstellen durchströmte das LC-Eluat die Fritte oder die CF-FAB-Kanäle und bildete an der Spitze einen gleichmäßigen Flüssigkeitsfilm. Dort wurde die Flüssigkeit mit Ionenstrahlen oder hochenergetischen Atomen (Fast Atoms) beschossen. Für einen stabilen Betrieb konnten die FAB-basierten Schnittstellen nur Flüssigkeitsflussraten von 1–15 μl verarbeiten und waren zudem auf Mikro- und Kapillarsäulen beschränkt. Für die Verwendung in FAB-MS-Ionisationsquellen mussten die Analyten mit einer Matrix (z. B. Glycerin) vermischt werden, die vor oder nach der Trennung in der LC-Säule zugegeben werden konnte. FAB-basierte Schnittstellen wurden häufig zur Charakterisierung von Peptiden eingesetzt, verloren jedoch mit dem Aufkommen von Elektrospray- basierten Schnittstellen im Jahr 1988 an Bedeutung. [ 5 ] [ 9 ]

Flüssigkeitschromatographie

Diagramm eines LC–MS-Systems

Die Flüssigkeitschromatographie (LC) ist eine Methode der physikalischen Trennung, bei der die Komponenten eines Flüssigkeitsgemisches zwischen zwei nicht mischbaren Phasen, der stationären und der mobilen Phase, verteilt werden. Die LC lässt sich in fünf Kategorien unterteilen: Adsorptionschromatographie , Verteilungschromatographie , Ionenaustauschchromatographie , Größenausschlusschromatographie und Affinitätschromatographie . Die am weitesten verbreitete Variante ist die Umkehrphasenchromatographie (RP-Chromatographie), bei der eine unpolare ( hydrophobe ) stationäre Phase und eine polare mobile Phase verwendet werden. Üblicherweise besteht die mobile Phase aus einem Gemisch von Wasser und anderen polaren Lösungsmitteln (wie Methanol , Isopropanol und Acetonitril ). Die stationäre Matrix wird hergestellt, indem langkettige Alkylgruppen (wie n-Octadecyl oder C<sub> 18</sub> ) an die äußere und innere Oberfläche von unregelmäßig oder kugelförmig geformten, porösen Silicapartikeln mit einem Durchmesser von 5 μm gebunden werden. [ 5 ]

In der HPLC werden typischerweise 20 μl der zu untersuchenden Probe in den mittels einer Hochdruckpumpe geförderten mobilen Phasenstrom injiziert. Die die Analyten enthaltende mobile Phase durchdringt das stationäre Phasenbett in definierter Richtung. Die Komponenten des Gemisches werden in Abhängigkeit von ihrer chemischen Affinität zur mobilen und stationären Phase getrennt. Die Trennung erfolgt nach wiederholten Sorptions- und Desorptionsschritten , die bei der Wechselwirkung der Flüssigkeit mit dem stationären Bett auftreten. [ 9 ] Das flüssige Lösungsmittel (mobile Phase) wird unter hohem Druck (bis zu 400 bar oder 5800 psi) in eine gepackte Säule mit der stationären Phase geleitet. Der hohe Druck ist notwendig, um eine konstante Flussrate für reproduzierbare chromatographische Experimente zu gewährleisten. Abhängig von der Verteilung zwischen mobiler und stationärer Phase verlassen die Probenkomponenten die Säule zu unterschiedlichen Zeiten. [ 17 ] Die Säule ist die wichtigste Komponente des LC-Systems und muss dem hohen Flüssigkeitsdruck standhalten. Konventionelle LC-Säulen sind 100–300 mm lang, haben einen Außendurchmesser von 6,4 mm (1/4 Zoll) und einen Innendurchmesser von 3,0–4,6 mm . Für LC-MS-Anwendungen können die Chromatographiesäulen kürzer (30–50 mm) sein und mit Packungspartikeln von 3–5 μm Durchmesser ausgestattet werden. Neben dem konventionellen Modell gibt es weitere LC-Säulentypen wie Schmalbohrungs-, Mikrobohrungs-, Mikrokapillar- und Nano-LC-Säulen. Diese Säulen weisen kleinere Innendurchmesser auf, ermöglichen eine effizientere Trennung und sind für Flüssigkeitsflüsse unter 1 ml/min (der üblichen Flussrate ) geeignet. [ 9 ] Zur Verbesserung der Trenneffizienz und der Peakauflösung kann anstelle der HPLC die Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPLC) eingesetzt werden. Diese LC-Variante verwendet Säulen, die mit kleineren Silicapartikeln (ca. 1,7 μm Durchmesser) gepackt sind, und erfordert höhere Betriebsdrücke im Bereich von 310.000 bis 775.000 Torr (6.000 bis 15.000 psi, 400 bis 1034 bar). [ 5 ]

Massenspektrometrie

LC-MS-Spektrum jedes aufgelösten Peaks

Die Massenspektrometrie (MS) ist eine Analysetechnik, die das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis ( m/z) geladener Teilchen ( Ionen ) misst. Obwohl es viele verschiedene Arten von Massenspektrometern gibt, nutzen sie alle elektrische oder magnetische Felder, um die Bewegung der aus einem Analyten erzeugten Ionen zu beeinflussen und deren m/z-Wert zu bestimmen. [ 19 ] Die grundlegenden Komponenten eines Massenspektrometers sind die Ionenquelle , der Massenanalysator , der Detektor sowie das Daten- und Vakuumsystem. In der Ionenquelle werden die Bestandteile einer in ein MS-System eingebrachten Probe mittels Elektronenstrahlen , Photonenstrahlen ( UV-Licht ), Laserstrahlen oder Koronaentladung ionisiert . Bei der Elektrospray-Ionisation überführt die Ionenquelle Ionen aus flüssiger Lösung in die Gasphase. Die Ionenquelle wandelt die neutralen Probenmoleküle in gasförmige Ionen um und fragmentiert diese, die dann dem Massenanalysator zugeführt werden. Während der Massenanalysator elektrische und magnetische Felder anwendet, um die Ionen nach ihren Massen zu sortieren, misst und verstärkt der Detektor den Ionenstrom, um die Häufigkeit jedes massenaufgelösten Ions zu berechnen. Um ein für das menschliche Auge leicht erkennbares Massenspektrum zu erzeugen , erfasst, verarbeitet, speichert und visualisiert das Datensystem die Daten in einem Computer. [ 5 ]

Das Massenspektrum dient zur Bestimmung der Masse der Analyten, ihrer elementaren und isotopischen Zusammensetzung sowie zur Aufklärung der chemischen Struktur der Probe. [ 5 ] Die Massenspektrometrie (MS) ist ein Experiment, das in der Gasphase und unter Vakuumbedingungen (1,33 × 10⁻² bis 1,33 × 10⁻⁶ Pascal) durchgeführt werden muss . Daher war die Entwicklung von Geräten, die den Übergang von Proben unter höherem Druck und in kondensierter Phase (fest oder flüssig) in ein Vakuumsystem ermöglichen, essenziell für die Etablierung der MS als leistungsstarkes Werkzeug zur Identifizierung und Quantifizierung organischer Verbindungen wie Peptide . [ 20 ] Die MS wird heute in analytischen Laboren, die physikalische, chemische oder biologische Eigenschaften einer Vielzahl von Verbindungen untersuchen, weit verbreitet eingesetzt. Unter den vielen verschiedenen Massenanalysatoren finden Quadrupol- , Flugzeit- (TOF-) , Ionenfalle- und Hybrid- Quadrupol-Flugzeit- (QTOF-) Analysatoren Anwendung in LC-MS-Systemen. [ 8 ]

Schnittstellen

Die Verbindung zwischen einer Flüssigphasentechnik (HPLC) mit kontinuierlich fließendem Eluat und einer Gasphasentechnik im Vakuum stellte lange Zeit eine Herausforderung dar. Die Einführung der Elektrospray-Ionisation ( ESI) änderte dies. Aktuell sind die gängigsten LC-MS-Schnittstellen die Elektrospray-Ionisation (ESI), die chemische Ionisation bei Atmosphärendruck (APCI) und die Photoionisation bei Atmosphärendruck (APPI). Diese neueren MS-Ionenquellen ermöglichen den Übergang von der Hochdruckumgebung (HPLC) zu den im MS-Analysator benötigten Hochvakuumbedingungen. [ 21 ] [ 8 ] Obwohl diese Schnittstellen einzeln beschrieben werden, sind sie auch als duale ESI/APCI-, ESI/APPI- oder APCI/APPI-Ionenquellen kommerziell erhältlich. [ 9 ] In der Vergangenheit wurden verschiedene Abscheidungs- und Trocknungstechniken, darunter auch Bandchromatographie, eingesetzt, wobei die Offline- MALDI- Abscheidung am häufigsten verwendet wurde. [ 22 ] [ 23 ] Ein neuer, noch in der Entwicklung befindlicher Ansatz, die sogenannte direkte EI-LC-MS-Schnittstelle , koppelt ein Nano-HPLC-System mit einem Massenspektrometer, das mit Elektronenionisation ausgestattet ist. [ 24 ] [ 25 ]

Elektrospray-Ionisation (ESI)

Die ESI-Schnittstelle für LC-MS-Systeme wurde 1988 von Fenn und Mitarbeitern entwickelt . [ 26 ] Diese Ionenquelle/Schnittstelle eignet sich zur Analyse von mäßig polaren und sogar stark polaren Molekülen (wie Metaboliten, Xenobiotika, Peptiden, Nukleotiden und Polysacchariden). Das aus der LC-Säule austretende flüssige Eluat wird in eine auf 3 bis 5 kV gehaltene Metallkapillare geleitet und durch einen koaxialen Hochgeschwindigkeitsgasstrom an der Kapillarspitze zerstäubt . Dadurch entsteht ein feiner Sprühnebel geladener Tröpfchen vor dem Eingang der Vakuumkammer. Um eine Kontamination des Vakuumsystems durch Puffer und Salze zu vermeiden , ist diese Kapillare üblicherweise senkrecht zum Einlass des MS-Systems angeordnet. In manchen Fällen wird dem Einlass ein Gegenstrom aus trockenem Stickstoff zugeführt, durch den die Ionen mittels des elektrischen Feldes geleitet werden. In einigen Quellen wird eine schnelle Tröpfchenverdampfung und damit eine maximale Ionenemission durch die Beimischung eines zusätzlichen Heißgasstroms zum Sprühstrahl vor dem Vakuumeintritt erreicht. In anderen Quellen werden die Tröpfchen beim Eintritt in das Vakuum durch ein beheiztes Kapillarröhrchen geleitet, was die Tröpfchenverdampfung und Ionenemission fördert. Diese Methoden zur Steigerung der Tröpfchenverdampfung ermöglichen nun den Einsatz von Flüssigkeitsflussraten von 1–2 ml/min bei gleichzeitig effizienter Ionisierung [ 27 ] und hoher Empfindlichkeit. Daher ist die Verwendung von 1–3 mm Mikrosäulen und niedrigeren Flussraten von 50–200 µl/min, die früher für einen optimalen Betrieb als notwendig galten, heute nicht mehr so ​​relevant. Die höhere Säulenkapazität von Säulen mit größerem Durchmesser kann nun vorteilhaft mit ESI-LC-MS-Systemen genutzt werden. Durch Umschalten der Polarität lassen sich positiv und negativ geladene Ionen erzeugen, und es ist möglich, innerhalb desselben LC-Laufs schnell abwechselnd positive und negative Spektren zu erfassen. Während die meisten großen Moleküle (MW > 1500–2000) in der ESI-Quelle mehrfach geladene Ionen erzeugen, erzeugen die meisten kleineren Moleküle einfach geladene Ionen. [ 8 ]

Chemische Ionisation bei Atmosphärendruck (APCI)

Die Entwicklung der APCI-Schnittstelle für LC-MS begann Anfang 1973 mit Horning und Mitarbeitern. [ 28 ] Ihre kommerzielle Anwendung erfolgte jedoch erst Anfang der 1990er Jahre, nachdem Henion und Mitarbeiter die LC-APCI-MS-Schnittstelle 1986 verbessert hatten. [ 9 ] Die APCI-Ionenquelle/Schnittstelle eignet sich zur Analyse kleiner, neutraler, relativ unpolarer und thermisch stabiler Moleküle (wie Steroide, Lipide und fettlösliche Vitamine). Diese Verbindungen lassen sich mit ESI nur unzureichend ionisieren. Darüber hinaus kann APCI auch mobile Phasen mit Puffern verarbeiten. Die Flüssigkeit aus dem LC-System wird durch eine Kapillare gepumpt, wobei an der Spitze eine Zerstäubung und eine Koronaentladung stattfindet. Zunächst werden das die Schnittstelle umgebende Ionisierungsgas und das Lösungsmittel der mobilen Phase in der Ionenquelle chemisch ionisiert. Anschließend reagieren diese Ionen mit dem Analyten und übertragen ihre Ladung. Die Probenionen passieren anschließend mithilfe von Ionenfokussierungslinsen kleine Skimmer. Im Hochvakuumbereich werden die Ionen massenspektrometrisch analysiert. Diese Schnittstelle kann im positiven und negativen Ladungsmodus betrieben werden, wobei hauptsächlich einfach geladene Ionen erzeugt werden. [ 8 ] Die APCI-Ionenquelle kann Flussraten zwischen 500 und 2000 μl/min verarbeiten und direkt an herkömmliche Säulen mit 4,6 mm Innendurchmesser angeschlossen werden. [ 17 ]

Atmosphärische Druckphotoionisation (APPI)

Die APPI-Schnittstelle für LC-MS wurde im Jahr 2000 von Bruins und Syage entwickelt. [ 29 ] [ 9 ] APPI ist eine weitere LC-MS-Ionenquelle/Schnittstelle zur Analyse neutraler Verbindungen, die nicht mittels ESI ionisiert werden können. [ 8 ] Diese Schnittstelle ähnelt der APCI-Ionenquelle, jedoch erfolgt die Ionisierung anstelle einer Koronaentladung durch Photonen einer Entladungslampe . Im direkten APPI-Modus werden einfach geladene Analyt-Molekülionen durch Absorption eines Photons und Emission eines Elektrons gebildet. Im Dotierstoff-APPI-Modus wird der mobilen Phase oder dem Zerstäubungsgas eine leicht ionisierbare Verbindung ( Dotierstoff ) zugesetzt, um eine Ladungsaustauschreaktion zwischen dem Dotierstoff-Molekülion und dem Analyten zu fördern. Die ionisierte Probe wird anschließend unter Hochvakuum und durch kleine Düsenskimmer in den Massenanalysator überführt. [ 9 ]

Anwendungen

Die Kopplung von Massenspektrometrie (MS) mit Flüssigkeitschromatographie (LC) ist attraktiv, da die Flüssigkeitschromatographie empfindliche und komplexe natürliche Gemische trennen kann, deren chemische Zusammensetzung genau bestimmt werden muss, wie beispielsweise biologische Flüssigkeiten, Umweltproben und Arzneimittel. Darüber hinaus findet LC-MS Anwendung in der Analyse flüchtiger Sprengstoffrückstände. [ 30 ] Heutzutage zählt LC-MS zu den am weitesten verbreiteten chemischen Analysetechniken, da über 85 % der natürlichen chemischen Verbindungen polar und thermisch labil sind und GC-MS diese Proben nicht verarbeiten kann. [ 5 ] HPLC-MS gilt beispielsweise als führende Analysetechnik für Proteomik- und pharmazeutische Labore. [ 8 ] [ 5 ] Weitere wichtige Anwendungen von LC-MS umfassen die Analyse von Lebensmitteln, Pestiziden und pflanzlichen Phenolen . [ 9 ]

Pharmakokinetik

Die LC-MS findet breite Anwendung in der Bioanalytik und wird insbesondere in pharmakokinetischen Studien von Arzneimitteln eingesetzt. Pharmakokinetische Studien sind notwendig, um zu bestimmen, wie schnell ein Wirkstoff aus den Organen und dem Leberblutkreislauf eliminiert wird . MS-Analysatoren sind in diesen Studien aufgrund ihrer kürzeren Analysenzeit sowie ihrer höheren Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu den üblicherweise in HPLC-Systemen verwendeten UV-Detektoren von Vorteil. Ein wesentlicher Vorteil ist die Verwendung von Tandem-MS/MS , bei dem der Detektor so programmiert werden kann, dass er bestimmte Ionen zur Fragmentierung auswählt. Die gemessene Größe ist die Summe der vom Anwender ausgewählten Molekülfragmente. Solange keine Interferenzen oder Ionensuppression in der LC-MS auftreten , kann die LC-Trennung sehr schnell durchgeführt werden. [ 31 ]

Proteomik/Metabolomik

Die LC-MS wird in der Proteomik zur Detektion und Identifizierung der Komponenten komplexer Gemische eingesetzt . Der Bottom-up- Ansatz der LC-MS in der Proteomik umfasst im Allgemeinen die Verdauung und Denaturierung der Peptide mit Trypsin als Protease, Harnstoff zur Denaturierung der Tertiärstruktur und Iodacetamid zur Modifizierung der Cysteinreste. Nach der Verdauung wird die LC-MS zur Peptidmassenfingerabdruckanalyse verwendet , oder LC-MS/MS ( Tandem-MS ) [ 32 ] dient der Sequenzierung einzelner Peptide [ 33 ] . LC-MS/MS wird am häufigsten für die proteomische Analyse komplexer Proben eingesetzt, bei denen sich Peptidmassen selbst mit hochauflösender Massenspektrometrie überlappen können. Proben komplexen biologischen Materials, wie z. B. Humanserum , können mit modernen LC-MS/MS-Systemen analysiert werden, die über 1000 Proteine ​​identifizieren können. Eine so hohe Proteinidentifizierung ist jedoch nur nach Probenauftrennung mittels SDS-PAGE-Gel oder HPLC-SCX möglich. [ 31 ] In jüngster Zeit wurde LC-MS/MS zur Suche nach Peptid- Biomarkern eingesetzt . Beispiele hierfür sind die kürzliche Entdeckung und Validierung von Peptid-Biomarkern für vier wichtige bakterielle Erreger von Atemwegsinfektionen ( Staphylococcus aureus , Moraxella catarrhalis , Haemophilus influenzae und Streptococcus pneumoniae ) sowie für das SARS-CoV-2- Virus. [ 34 ] [ 35 ]

Die Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) hat sich als eine der am häufigsten verwendeten Techniken zur globalen Metabolitenprofilierung biologischer Gewebe wie Blutplasma, Serum und Urin etabliert. [ 36 ] LC-MS wird auch zur Analyse von Naturstoffen und zur Profilierung sekundärer Pflanzenstoffe eingesetzt. [ 37 ] In diesem Zusammenhang sind MS-basierte Systeme hilfreich, um detailliertere Informationen über das breite Spektrum an Verbindungen aus komplexen biologischen Proben zu gewinnen. Die LC- NMR -Spektroskopie wird ebenfalls in der Pflanzenmetabolomik verwendet, kann aber nur die häufigsten Metaboliten detektieren und quantifizieren. LC-MS hat wesentlich zur Weiterentwicklung der Pflanzenmetabolomik beigetragen, deren Ziel es ist, das Pflanzensystem auf molekularer Ebene zu untersuchen und eine unvoreingenommene Charakterisierung des Pflanzenmetaboloms in Reaktion auf seine Umwelt zu ermöglichen. [ 38 ] Die erste Anwendung der LC-MS in der Pflanzenmetabolomik war der Nachweis einer Vielzahl hochpolarer Metabolite, Oligosaccharide , Aminosäuren , Aminozucker und Zuckernukleotide aus Phloemgewebe von Cucurbita maxima . [ 39 ] Ein weiteres Beispiel für die Anwendung der LC-MS in der Pflanzenmetabolomik ist die effiziente Trennung und Identifizierung von Glucose , Saccharose , Raffinose , Stachyose und Verbascose aus Blattextrakten von Arabidopsis thaliana . [ 40 ]

Arzneimittelentwicklung

Die LC-MS wird häufig in der Arzneimittelentwicklung eingesetzt, da sie eine schnelle Molekulargewichtsbestimmung und Strukturaufklärung ermöglicht . Diese Eigenschaften beschleunigen die Generierung, Testung und Validierung von Wirkstoffen aus einer Vielzahl potenziell anwendbarer Produkte. LC-MS-Anwendungen in der Arzneimittelentwicklung sind hochautomatisierte Methoden, die für Peptid- und Glykoprotein - Mapping, Lipidomik , Dereplikation von Naturstoffen, Bioaffinitäts-Screening, In-vivo -Wirkstoff-Screening, Screening der metabolischen Stabilität, Metaboliten- und Verunreinigungsidentifizierung, quantitative Bioanalyse und Qualitätskontrolle verwendet werden . [ 41 ]

Siehe auch

Referenzen

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