Multilocus-Sequenztypisierung ( MLST ) ist eine molekularbiologische Methode zur Typisierung mehrerer Loci . Dabei werden DNA-Sequenzen interner Fragmente verschiedener Haushaltsgene verwendet, um Isolate unterschiedlicher Spezies zu charakterisieren. MLST wird am häufigsten bei Mikroorganismen , vorwiegend Prokaryoten und Hefen, angewendet, da diese mit anderen Methoden oft schwer zu differenzieren sind.

Das erste MLST-Schema wurde für Neisseria meningitidis entwickelt [ 1 ] , den Erreger der Meningokokkenmeningitis und -sepsis . Seit seiner Einführung in die Erforschung der Evolutionsgeschichte wird MLST nicht nur für humane, sondern auch für pflanzliche Krankheitserreger eingesetzt [ 2 ] .

Prinzip

MLST misst direkt die DNA-Sequenzvariationen in einer Reihe von Haushaltsgenen und charakterisiert Stämme anhand ihrer einzigartigen Allelprofile. Das Prinzip von MLST ist einfach: Die Technik umfasst die PCR- Amplifikation mit anschließender DNA-Sequenzierung . Nukleotidunterschiede zwischen Stämmen können in einer variablen Anzahl von Genen untersucht werden, je nach gewünschtem Differenzierungsgrad.

Der MLST-Workflow umfasst: 1) Datenerfassung, 2) Datenanalyse und 3) Multilocus -Sequenzanalyse . Im Schritt der Datenerfassung erfolgt die eindeutige Identifizierung von Variationen durch die Bestimmung der Nukleotidsequenz von Genfragmenten. Im Schritt der Datenanalyse werden allen eindeutigen Sequenzen Allelnummern zugewiesen , sie werden zu einem Allelprofil zusammengefasst und einem Sequenztyp (ST) zugeordnet. Werden neue Allele und STs gefunden, werden sie nach der Überprüfung in der Datenbank gespeichert. Im letzten Analyseschritt von MLST wird die Verwandtschaft von Isolaten durch den Vergleich von Allelprofilen ermittelt. Forscher führen epidemiologische und phylogenetische Studien durch, indem sie STs verschiedener Klonkomplexe vergleichen. Da während des Sequenzierungs- und Identifizierungsprozesses eine große Datenmenge entsteht, werden bioinformatische Techniken eingesetzt, um alle biologischen Daten zu ordnen, zu verwalten, zu analysieren und zusammenzuführen.

Um ein ausgewogenes Verhältnis zwischen akzeptabler Identifizierungsleistung, Zeitaufwand und Kosten für die Stammtypisierung zu erzielen, werden in Laboren üblicherweise sieben bis acht Haushaltsgene verwendet. Am Beispiel von Staphylococcus aureus lassen sich sieben Haushaltsgene für die MLST-Typisierung veranschaulichen. Diese Gene umfassen Carbamatkinase ( arcC ), Shikimatdehydrogenase ( aroE ), Glycerinkinase ( glpF ), Guanylatkinase ( gmk ), Phosphatacetyltransferase ( pta ), Triosephosphatisomerase ( tpi ) und Acetyl-Coenzym-A-Acetyltransferase ( yqiL ), wie auf der MLST-Website angegeben. Es ist jedoch nicht ungewöhnlich, bis zu zehn Haushaltsgene zu verwenden. Für Vibrio vulnificus werden folgende Haushaltsgene verwendet: Glucose-6-phosphat-Isomerase ( glp ), DNA-Gyrase, Untereinheit B ( gyrB ), Malat-Lactat-Dehydrogenase ( mdh ), Methionyl-tRNA-Synthetase ( metG ), Phosphoribosylaminoimidazol-Synthetase ( purM ), Threonin-Dehydrogenase ( dtdS ), Diaminopimelat-Decarboxylase ( lysA ), Transhydrogenase-α-Untereinheit ( pntA ), Dihydroorotase ( pyrC ) und Tryptophanase ( tnaA ). Daher können sowohl die Anzahl als auch die Art der mittels MLST untersuchten Haushaltsgene von Spezies zu Spezies variieren.

Für jedes dieser Haushaltsgene werden die verschiedenen Sequenzen als Allele zugeordnet, und die Allele an den Loci ergeben ein Allelprofil. Eine Reihe von Profilen kann dann als Identifikationsmarker für die Stammtypisierung dienen. Sequenzen, die sich auch nur in einem einzigen Nukleotid unterscheiden, werden als unterschiedliche Allele zugeordnet. Die Anzahl der Nukleotidunterschiede zwischen den Allelen wird nicht gewichtet, da wir nicht unterscheiden können, ob Unterschiede an mehreren Nukleotidpositionen auf mehrere Punktmutationen oder einen einzelnen Rekombinationsaustausch zurückzuführen sind. Die große Anzahl potenzieller Allele an jedem Locus ermöglicht die Unterscheidung von Milliarden verschiedener Allelprofile. Ein Stamm mit dem häufigsten Allel an jedem Locus tritt voraussichtlich nur zufällig etwa einmal unter 10.000 Isolaten auf. Obwohl MLST eine hohe Diskriminierungsfähigkeit bietet, ist die Akkumulation von Nukleotidveränderungen in Haushaltsgenen ein relativ langsamer Prozess, und das Allelprofil eines Bakterienisolats ist über die Zeit ausreichend stabil, sodass sich die Methode ideal für die globale Epidemiologie eignet.

Die Verwandtschaft der Isolate wird als Dendrogramm dargestellt , das anhand der Matrix paarweiser Unterschiede ihrer Allelprofile, eBURST oder eines minimalen Spannbaums (MST) erstellt wird. Das Dendrogramm dient lediglich der Veranschaulichung von Isolaten mit identischen oder sehr ähnlichen Allelprofilen, die vermutlich von einem gemeinsamen Vorfahren abstammen. Die Verwandtschaftsverhältnisse zwischen Isolaten, die sich an mehr als drei von sieben Loci unterscheiden, sind wahrscheinlich unzuverlässig und sollten nicht zur Bestimmung ihrer Phylogenie herangezogen werden. [ 3 ] [ 4 ] Der MST verbindet alle Proben so, dass die Summe der Abstände aller Äste des Baums minimal ist. [ 5 ]

Alternativ kann auch die Verwandtschaft der Isolate analysiert werden mitMultilocus-Sequenzanalyse ( MLSA ). Diese Methode verwendet nicht die zugewiesenen Allele, sondern verknüpft die Sequenzen der Genfragmente der Haushaltsgene und nutzt diese verknüpfte Sequenz zur Bestimmung phylogenetischer Verwandtschaftsverhältnisse. Im Gegensatz zur MLST ordnet diese Analyse Sequenzen, die sich nur in einem Nukleotid unterscheiden, eine höhere Ähnlichkeit zu und Sequenzen mit mehreren Nukleotidunterschieden eine geringere. Daher eignet sich diese Analyse besser für Organismen mit klonaler Evolution und weniger für Organismen, bei denen häufig Rekombinationsereignisse auftreten. Sie kann auch zur Bestimmung phylogenetischer Verwandtschaftsverhältnisse zwischen eng verwandten Arten verwendet werden. [ 6 ] Die Begriffe MLST und MLSA werden oft synonym verwendet. Dies ist jedoch nicht korrekt, da jede Analysemethode ihre spezifischen Merkmale und Anwendungsgebiete hat. Es sollte daher darauf geachtet werden, den korrekten Begriff zu verwenden.

Vergleich mit anderen Techniken

Frühere serologische Typisierungsverfahren dienten der Differenzierung bakterieller Isolate, doch die immunologische Typisierung weist Nachteile auf, wie die Beschränkung auf wenige antigene Loci und die unvorhersehbare Reaktivität von Antikörpern gegenüber verschiedenen antigenen Varianten. Zur Bestimmung der Verwandtschaft von Krankheitserregern wurden verschiedene molekulare Typisierungsverfahren vorgeschlagen, darunter Pulsfeld-Gelelektrophorese ( PFGE ), Ribotypisierung und PCR-basiertes Fingerprinting . Diese auf DNA-Banden basierenden Subtypisierungsmethoden liefern jedoch keine aussagekräftigen evolutionären Analysen. Obwohl PFGE von vielen Forschern als Goldstandard angesehen wird, sind viele Stämme aufgrund des DNA-Abbaus während des Prozesses (Gelschmieren) mit dieser Technik nicht typisierbar.

Der Ansatz der Multilocus-Synthese (MLST) unterscheidet sich von der Multilocus-Enzymelektrophorese (MLEE), die auf den unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilitäten (EM) mehrerer zentraler Stoffwechselenzyme basiert. Die Allele an jedem Locus bestimmen die EM ihrer Produkte, da unterschiedliche Aminosäuresequenzen zwischen Enzymen zu unterschiedlichen Mobilitäten und distinkten Banden im Gel führen. Die Verwandtschaft von Isolaten lässt sich anschließend mithilfe eines Dendrogramms visualisieren, das aus der Matrix der paarweisen Unterschiede zwischen den elektrophoretischen Typen erstellt wird. Diese Methode weist aus mehreren Gründen eine geringere Auflösung als MLST auf, die alle darauf beruhen, dass die Diversität des enzymatischen Phänotyps lediglich ein Indikator für die Diversität der DNA-Sequenz ist. Erstens können Enzyme unterschiedliche Aminosäuresequenzen aufweisen, ohne dass sich ihre EM ausreichend unterscheidet, um distinkte Banden zu erzeugen. Zweitens können „stille Mutationen“ die DNA-Sequenz eines Gens verändern, ohne die kodierten Aminosäuren zu beeinflussen. Drittens kann der Phänotyp des Enzyms leicht durch Umwelteinflüsse verändert werden, was die Reproduzierbarkeit von MLEE-Ergebnissen stark beeinträchtigt. Häufige Enzymmodifikationen sind Phosphorylierung, Cofaktorbindung und Spaltung von Transportsequenzen. Dies schränkt auch die Vergleichbarkeit von MLEE-Daten verschiedener Labore ein, wohingegen MLST portable und vergleichbare DNA-Sequenzdaten liefert und großes Potenzial für Automatisierung und Standardisierung bietet.

MLST ähnelt dem DNA-Barcoding insofern, als beide versuchen, anhand partieller genetischer Informationen Populationen von Organismen zu unterscheiden. DNA-Barcoding dient jedoch der Unterscheidung zwischen Arten und bevorzugt die Verwendung von ein oder zwei kurzen Fragmenten mit relativ hohen Mutationsraten (z. B. Fragmente der mtDNA oder rDNA), die typischerweise eine signifikante Sequenzvariation zwischen Arten aufweisen. Ist dies nicht der Fall, können mehrere Loci verwendet werden [ 7 ] , wobei der Fokus im Gegensatz zu MLST jedoch weiterhin auf der Artebene liegt [ 8 ] .

Vorteile und Anwendungsgebiete

MLST ist hochgradig eindeutig und portabel. Die für die ST-Bestimmung benötigten Materialien können zwischen Laboren ausgetauscht werden. Primersequenzen und Protokolle sind elektronisch zugänglich. Das Verfahren ist reproduzierbar und skalierbar. MLST ist automatisiert und kombiniert Fortschritte in der Hochdurchsatzsequenzierung und Bioinformatik mit etablierten populationsgenetischen Techniken. MLST-Daten können zur Untersuchung evolutionärer Verwandtschaftsverhältnisse zwischen Bakterien genutzt werden. MLST bietet eine hohe Diskriminierungsfähigkeit zur Differenzierung von Isolaten.

Die Anwendungsmöglichkeiten der MLST sind vielfältig und stellen eine wertvolle Ressource für die Wissenschaft, das öffentliche Gesundheitswesen, die Veterinärmedizin sowie die Lebensmittelindustrie dar. Im Folgenden finden Sie Beispiele für MLST-Anwendungen.

Campylobacter

Campylobacter ist der häufigste Erreger bakterieller Infektionen des Darms, die meist durch den Verzehr von unzureichend gegartem Geflügel oder Rohmilch verursacht werden. Die Epidemiologie von Campylobacter ist jedoch unzureichend erforscht, da Ausbrüche selten erkannt werden und sich die Infektionsquellen und Übertragungswege nur schwer nachverfolgen lassen. Zudem weisen Campylobacter- Genome eine hohe genetische Diversität und Instabilität mit häufiger inter- und intragenomischer Rekombination sowie Phasenvariation auf, was die Interpretation der Daten vieler Typisierungsmethoden erschwert. Mit der Anwendung der MLST-Technik konnte die Campylobacter -Typisierung bis vor Kurzem große Erfolge erzielen und die MLST-Datenbank erweitern. Stand 1. Mai 2008 enthielt die Campylobacter- MLST-Datenbank 3516 Isolate und etwa 30 Publikationen, die MLST in der Campylobacter -Forschung verwenden oder erwähnen( http://pubmlst.org/campylobacter/ ).

Neisseria meningitidis

Die MLST-Methode hat ein differenzierteres Bild von Bakterien in menschlichen Populationen und von Stammvarianten geliefert, die für Menschen, Pflanzen und Tiere pathogen sein können. Die MLST-Technik wurde erstmals von Maiden et al. (1) zur Charakterisierung von Neisseria meningitidis anhand von sechs Loci eingesetzt. Durch die Anwendung der MLST konnten die wichtigsten Meningokokken-Linien, die weltweit für invasive Erkrankungen verantwortlich sind, eindeutig identifiziert werden. Um die Unterscheidung zwischen den wichtigsten invasiven Linien zu verbessern, werden mittlerweile sieben Loci verwendet, die von vielen Laboren als Methode der Wahl zur Charakterisierung von Meningokokken-Isolaten akzeptiert wurden. Es ist bekannt [ 9 ] , dass in N. meningitidis häufig Rekombinationsprozesse stattfinden , die zu einer raschen Diversifizierung von Meningokokken-Klonen führen. Die MLST hat sich als zuverlässige Methode zur Charakterisierung von Klonen anderer Bakterienarten bewährt, bei denen die klonale Diversifizierung im Allgemeinen langsamer verläuft.

Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus verursacht zahlreiche Erkrankungen. Methicillin-resistenter S. aureus ( MRSA ) gibt aufgrund seiner Resistenz gegen nahezu alle Antibiotika außer Vancomycin zunehmend Anlass zur Sorge. Die meisten schweren S.-aureus -Infektionen außerhalb von Krankenhäusern und viele davon im Krankenhaus werden jedoch durch Methicillin-empfindliche Isolate (MSSA) verursacht. Bislang gab es nur wenige Versuche, die mit schweren Erkrankungen assoziierten hypervirulenten MSSA-Klone zu identifizieren. Daher wurde MLST entwickelt, um eine eindeutige Methode zur Charakterisierung von MRSA-Klonen und zur Identifizierung der mit schweren Erkrankungen assoziierten MSSA-Klone bereitzustellen.

Streptococcus pyogenes

Streptococcus pyogenes verursacht Erkrankungen, die von Pharyngitis bis hin zu lebensbedrohlicher Impetigo, einschließlich nekrotisierender Fasziitis, reichen. Für S. pyogenes wurde ein MLST-Schema entwickelt. Die Datenbank ( mlst.net ) [ 10 ] enthält derzeit die Allelprofile von Isolaten, die die weltweite Diversität des Organismus repräsentieren, sowie Isolate aus schweren invasiven Erkrankungen. [ 11 ]

Candida albicans

Candida albicans ist ein humanpathogener Pilz, der für nosokomiale Blutstrominfektionen verantwortlich ist. Die MLST-Technik wird zur Charakterisierung von C. albicans -Isolaten eingesetzt. Die Kombination der Allele an den verschiedenen Loci führt zu einzigartigen diploiden Sequenztypen, die zur Unterscheidung von Stämmen verwendet werden können. MLST hat sich in Studien zur Epidemiologie von C. albicans im Krankenhaus sowie zur Diversität von C. albicans -Isolaten aus verschiedenen ökologischen Nischen, einschließlich menschlicher und tierischer Wirte, bewährt.

Cronobacter

Die Gattung Cronobacter umfasst sieben Arten. Vor 2007 wurden diese Organismen unter dem Artnamen Enterobacter sakazakii zusammengefasst. Das Cronobacter- MLST-Schema wurde ursprünglich zur Unterscheidung von C. sakazakii und C. malonaticus eingesetzt , da die 16S-rDNA-Sequenzierung nicht immer ausreichend genau und die Biotypisierung zu subjektiv ist. [ 12 ] Das Cronobacter -MLST-Schema verwendet sieben Allele: atpD , fusA , glnS , gltB , gyrB , infB und ppsA. Daraus ergibt sich eine 3036 bp lange Sequenz für phylogenetische Analysen (MLSA) und vergleichende Genomik . [ 13 ] MLST wurde auch zur formalen Anerkennung neuer Cronobacter- Arten verwendet. [ 14 ] Mit dieser Methode konnte ein starker Zusammenhang zwischen einer genetischen Linie, Sequenztyp 4 (ST4), und Fällen von neonataler Meningitis nachgewiesen werden. [ 15 ] Die Cronobacter MLST-Website finden Sie unter http://www.pubMLST.org/cronobacter .

Einschränkungen

MLST eignet sich am besten für populationsgenetische Studien, ist aber kostspielig. Aufgrund der Sequenzkonservierung von Haushaltsgenen mangelt es MLST mitunter an der nötigen Unterscheidungskraft, um Bakterienstämme zu differenzieren, was ihren Einsatz in epidemiologischen Untersuchungen einschränkt. Um die Unterscheidungskraft von MLST zu verbessern, wurde ein Multi-Virulenz-Locus-Sequenztypisierungsansatz (MVLST) mit Listeria monocytogenes entwickelt . [ 16 ] MVLST erweitert die Vorteile von MLST, zielt aber auf Virulenzgene ab, die polymorpher sein können als Haushaltsgene. Populationsgenetik ist nicht der einzige relevante Faktor bei einer Epidemie. Virulenzfaktoren spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Krankheitsentstehung, und populationsgenetische Studien haben Schwierigkeiten, diese zu erfassen. Dies liegt daran, dass die beteiligten Gene im Vergleich zum populationsgenetischen Rahmen oft eine hohe Rekombinationsrate aufweisen und zwischen Stämmen mobil sind. So ist beispielsweise bei Escherichia coli die Identifizierung von Stämmen mit Toxingenen wichtiger als eine populationsgenetische Bewertung der vorherrschenden Stämme.

Die Einführung von Sequenzierungstechnologien der zweiten Generation ermöglicht es, Sequenzinformationen des gesamten bakteriellen Genoms mit vergleichsweise geringem Aufwand und Kosten zu gewinnen. Die MLST-Klassifizierung kann nun anhand der Gesamtgenomsequenz erfolgen, anstatt wie bei der Entwicklung der MLST-Klassifizierung jeden Locus einzeln zu sequenzieren. [ 17 ] Die Gesamtgenomsequenzierung liefert umfassendere Informationen zur Differenzierung von Bakterienstämmen (MLST verwendet etwa 0,1 % der Genomsequenz zur Typisierung und ignoriert den Rest des bakteriellen Genoms). Beispielsweise zeigte die Gesamtgenomsequenzierung zahlreicher Isolate, dass die MLST-Linie ST258 von Klebsiella pneumoniae aus zwei unterschiedlichen genetischen Kladen besteht. [ 18 ] Dies liefert zusätzliche Informationen zur Evolution und Verbreitung dieser multiresistenten Organismen und widerlegt die bisherige Hypothese eines einzigen klonalen Ursprungs von ST258. [ 19 ]

Datenbanken

MLST-Datenbanken enthalten die Referenz-Allelsequenzen und Sequenztypen für jeden Organismus sowie isolierte epidemiologische Daten. Die Websites bieten Abfrage- und Analysesoftware, mit der Benutzer ihre Allelsequenzen und Sequenztypen abfragen können. MLST wird häufig von Forschern und Mitarbeitern im öffentlichen Gesundheitswesen eingesetzt.

Die Mehrheit der MLST-Datenbanken wird auf einem Webserver gehostet, der sich derzeit an der Universität Oxford befindet ( pubmlst.org ).

Die auf der Website gehostete Datenbank enthält die organismenspezifischen Referenz-Allelsequenzen und Listen von STs für einzelne Organismen.

Um das Sammeln und Formatieren der verwendeten Sequenzen zu erleichtern, wurde ein einfaches und kostenloses Plug-in für Firefox entwickelt ( Link archiviert am 22.02.2014 in der Wayback Machine ).

Referenzen

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Weiterführende Literatur