Mikrotox-Bioassay

Microtox ist ein In-vitro -Testsystem, das biolumineszente Bakterien ( Allivibrio fischeri , früher Vibrio fischeri ) zur Detektion toxischer Substanzen in verschiedenen Substraten wie Wasser, Luft, Böden und Sedimenten nutzt . ^{[ 1 ]} Allivibrio fischeri sind nicht-pathogene, marine Bakterien , die im Rahmen ihres Stoffwechsels natürlicherweise lumineszieren . ^{[ 2 ]} Bei Kontakt mit einer toxischen Substanz wird die Atmung der Bakterien gestört, wodurch die Lichtemission reduziert wird. ^{[ 2 ]} Allivibrio fischeri weisen eine hohe Sensitivität gegenüber einer Vielzahl toxischer Substanzen auf. Die Reaktion auf Toxizität äußert sich in einer Veränderung der Lumineszenz, einem Nebenprodukt der Zellatmung . ^{[ 2 ]} Aus dieser Veränderung lässt sich die prozentuale Hemmung von Allivibrio fischeri berechnen , die direkt mit der Toxizität korreliert. ^{[ 2 ]}

Microtox wurde 1979 von Azur Environmental (ehemals Microbics Corporation) als kostengünstige Alternative zu den damals verfügbaren Toxizitätstests entwickelt. ^{[ 3 ] [ 4 ]} Vor Microtox konzentrierten sich die meisten verfügbaren Toxizitätstests für Wasser speziell auf Fische und Daphnien. ^{[ 3 ] [ 4 ]} Seit seiner Einführung hat sich Microtox zu einer Standardmethode für die Prüfung der Toxizität von Wasser sowie anderer Substrate wie Böden und Sedimenten entwickelt. ^{[ 3 ] [ 5 ] [ 6 ]}

In den letzten Jahren wechselten die Microtox-Technologie und der Name mehrfach den Besitzer. 2011 erwarb Modern Water Microtox und zugehörige Technologien von Strategic Diagnostics Incorporated (SDIX) für rund 4,5 Millionen US-Dollar. ^{[ 7 ]} Vor der Übernahme durch SDIX befand sich Microtox im Besitz des ursprünglichen Entwicklers Azur Environmental. ^{[ 3 ]}

Microtox nutzt biolumineszente Bakterien ( Allivibrio fischeri ), um die Toxizität bestimmter Substanzen und/oder Substrate zu bestimmen. ^{[ 3 ] [ 5 ]} Diese Bakterien emittieren im Rahmen ihrer Zellatmung Licht , das als Lumineszenz gemessen werden kann. ^{[ 3 ]} Bei Kontakt mit toxischen Substanzen ist eine Abnahme der Lumineszenz zu beobachten, deren prozentuale Veränderung direkt mit der Toxizität korreliert. ^{[ 4 ]} Allivibrio fischeri wurde speziell ausgewählt, da diese Bakterien durch Gefriertrocknung haltbar gemacht werden können, was ihre Haltbarkeit und Anwendungsmöglichkeiten verlängert. ^{[ 3 ]} Mit dieser Technologie lassen sich sowohl akute Toxizitätstests in der Festphase (Böden und Sedimente) als auch in wässrigen Lösungen (siehe unten) durchführen. ^{[ 6 ]}

Das Microtox Modell 500 ist ein Laborphotometer zur Messung akuter Toxizität . Dieses Analysegerät ist ein temperaturkontrolliertes, selbstkalibrierendes Biosensor- Messsystem, das die Biolumineszenz von Allivibrio fischeri nutzt , um die Toxizität von kontaminiertem Wasser oder Eluaten kontaminierter Böden und Sedimente zu bestimmen. ^{[ 8 ]}

Der Microtox Continuous Toxicity Monitor (CTM) ist ein standortspezifischer Microtox-Analysator, der die Toxizität einer Wasserquelle kontinuierlich misst und die Ergebnisse sofort liefert. Dieser vollautomatische Analysator verfügt über einen breiten Messbereich und kann mehrere tausend Schadstoffe gleichzeitig identifizieren, unabhängig davon, ob die Kontaminationsquelle bekannt ist. Das Gerät kann bis zu vier Wochen lang kontinuierlich betrieben werden und ist einfach zu bedienen und zu warten. ^{[ 9 ]}

Das DeltaTox II ist ein tragbares Gerät zur Bestimmung der akuten Toxizität und des Adenosintriphosphat-Gehalts (ATP). Es ist auch als tragbare Version des Microtox Modells 500 bekannt und ermöglicht einfache Tests, benötigt nur geringe Probenmengen und ist eine kostengünstige Methode zur Wasseranalyse. Dieser empfindliche und schnelle Analysator kann mikrobielle Verunreinigungen sowie über 2.700 verschiedene Chemikalien nachweisen. ^{[ 10 ]}

Die Haltbarkeit des Akutreagenz beträgt zwei Jahre, die der Lösungen drei Jahre, sofern diese sachgemäß gelagert werden. ^{[ 11 ]}

Das Microtox-Akutreagenz ist eine gefriergetrocknete Kultur von Allivibrio fischeri , die vor dem Test rekonstituiert wird. Es wird empfohlen, das Reagenz innerhalb von drei Stunden nach der Rekonstitution zu verwenden. Nach Ablauf dieser Zeit kann sich die Empfindlichkeit des Reagenz verändern. ^{[ 11 ]}

Die Microtox Osmotic Adjustment Solution (MOAS) ist eine ungiftige Lösung, die aus 22 % Natriumchlorid ( NaCl ) und Reinstwasser besteht . Diese Lösung wird einer Probe zugesetzt, um den osmotischen Druck auf etwa 2 % NaCl einzustellen . ^{[ 11 ]}

Die Rekonstitutionslösung besteht aus speziell aufbereitetem, ungiftigem Reinstwasser. ^{[ 11 ]}

Das Verdünnungsmittel ist eine ungiftige Lösung aus 2 % NaCl in Reinstwasser. Diese Lösung dient zum Verdünnen der Probe und des Reagenz und bietet zudem den für Allivibrio fischeri notwendigen osmotischen Schutz . ^{[ 11 ] [ 12 ]}

Microtox kann auf verschiedene Matrices angewendet werden, darunter Trinkwasser , Oberflächenabfluss , Abwasser , Industrieabwässer, Böden und Sedimente. ^{[ 5 ]} Die meisten Proben benötigen außer der Einstellung des Salzgehalts auf 2 % keine spezielle Vorbereitung. ^{[ 3 ]} Proben mit bestimmten Eigenschaften, wie z. B. hoher Trübung , können jedoch eine spezielle Vorbereitung erfordern. ^{[ 3 ]} Ist eine Salzgehaltsanpassung erforderlich , kann diese durch Zugabe einer entsprechenden Menge Microtox-Osmotische-Einstelllösung (MOAS) erfolgen. Beispielsweise führt die Zugabe von 0,1 ml MOAS zu 1 ml Probe zu einer Verdünnung auf 90,9 % der ursprünglichen Konzentration. ^{[ 3 ]} Ist ein höherer Salzgehalt erforderlich , kann dieser durch Auflösen von festem Natriumchlorid in der Probe erreicht werden , um einen Endsalzgehalt von 2 % zum Schutz von Allivibrio fischeri zu erzielen . ^{[ 3 ]} Stark getrübte Proben mit Partikeln müssen vor der Durchführung des Tests sedimentieren. ^{[ 3 ]} Partikel in der Probe können die Biolumineszenz durch Lichtabsorption stören und zu irreführenden Testergebnissen führen. Störungen der Lumineszenz können auch bei stark gefärbten Proben (insbesondere roten, braunen oder schwarzen) auftreten. ^{[ 3 ]} Gegebenenfalls müssen die Proben zentrifugiert werden , um eine für den Test ausreichende Klarheit zu erreichen. ^{[ 3 ]} Chlorhaltige Proben können die Toxizität gegenüber Allivibrio fischeri verändern und ebenfalls zu irreführenden Ergebnissen führen. Die Proben können mit einer Natriumthiosulfat -Lösung in deionisiertem Wasser entchlort werden , ohne die Testergebnisse zu beeinflussen. ^{[ 3 ]} Idealerweise sollte der pH-Wert der Proben nicht verändert werden, da es vorzuziehen ist, jede Probe mit dem ursprünglichen pH- Wert zu testen . Ist eine pH-Wert -Anpassung dennoch notwendig, sollte diese durch Zugabe von Natriumhydroxidlösung oder Salzsäure erfolgen . ^{[ 3 ]}

Im Gegensatz zu Wasserproben sind Boden- und Sedimentproben nicht homogen. ^{[ 13 ]} Daher ist es schwierig, repräsentative Proben aus solchen Matrices zu gewinnen. Toxische Substanzen binden sich bevorzugt an Partikel, wobei das Ausmaß der Bindung von der Zusammensetzung der Partikel abhängt. Kleinere Partikel wie Ton neigen beispielsweise dazu, Chemikalien stark zu binden und wirken wie Ionenaustauscherharze . ^{[ 12 ] [ 13 ]} Die Microtox-Tests für Sedimente und Böden unterscheiden sich in der Vorbereitung der Matrix für den Kontakt mit Allivibrio fischeri . Um eine repräsentative Boden- oder Sedimentprobe zu erhalten, ist ein Eluattest erforderlich. Sedimentelutrate können durch Extraktion mit destilliertem Wasser, Salzwasser oder einem organischen Lösungsmittel wie Methylenchlorid oder Hexan hergestellt werden . ^{[ 12 ]} Für einen Eluattest wird eine Bodenprobe für eine bestimmte Zeit mit einem Extraktionsmittel vermischt, anschließend sedimentieren gelassen und eine Probe des Extrakts entnommen. Falls die entnommene Probe Partikel enthält, kann es erforderlich sein, die Probe zur Erzielung optimaler Klarheit zu zentrifugieren . Darüber hinaus kann das Porenwasser von Sedimenten durch Zentrifugation gewonnen und ohne Extraktion untersucht werden. ^{[ 12 ]}

Es gibt fünf Haupttests für Microtox: den Basistest, den 100%-Test, den Festphasentest, den Vergleichstest und den Hemmtest. Drei dieser Tests – der Basistest, der 100%-Test und der Festphasentest – werden für die Untersuchung von Sedimenten und Böden verwendet. ^{[ 12 ]} Alle Varianten folgen dem gleichen allgemeinen Verfahren zur Rekonstitution des Allivibrio fischeri -Reagenz in der Rekonstitutionslösung. Anschließend werden Korrekturen für Salzgehalt und Partikel vorgenommen und die Bakterien je nach Testmethode der Probenlösung ausgesetzt. Die Lichtemission der Bakterien wird fünf und 15 Minuten nach Exposition mit einem Photometer gemessen. ^{[ 12 ]} Die gemessene Lichtemission korreliert direkt mit der Toxizität der Probe und ermöglicht die Berechnung von EC50- oder IC50-Werten bzw. anderer ECxx- und ICxx-Werte. ^{[ 14 ]}

Der Basistest zur akuten Toxizität ist ein Verfahren zur Messung der relativen akuten Toxizität einer Probe. Dieser Test ist das beste Protokoll für die Untersuchung von Proben mit unbekannter oder hoher Toxizität oder wenn höchste Zuverlässigkeit und Präzision der Testergebnisse erforderlich sind. Der Test umfasst zwei Kontrollen und acht Probenverdünnungen, die jeweils in Doppelbestimmung durchgeführt werden. ^{[ 14 ]}

Der akute Toxizitätstest (100 %) ist ein Verfahren, bei dem die Probe in 100%iger Konzentration getestet wird. Dazu wird die Reagenzlösung direkt zur Probe gegeben. ^{[ 15 ]} Dieser Test wird für Proben mit erwartungsgemäß geringer Toxizität eingesetzt und dient im Allgemeinen als Screening-Instrument für Umweltproben. Im Vergleich zum Basistest reagiert er empfindlicher auf die Durchführung durch den Anwender und kann daher weniger präzise sein. ^{[ 12 ]}

Der akute Toxizitätstest in Festphase ist ein Verfahren, bei dem der Testorganismus in direkten Kontakt mit der festen Probe als Partikel in wässriger Suspension kommt. Normalerweise zeigt dieser Test im Vergleich zu Eluat- oder Porenwassertests derselben Probe eine gleichwertige oder höhere Toxizität an. ^{[ 16 ]} Dies ist auf eine gleichwertige oder erhöhte Bioverfügbarkeit durch den direkten Kontakt zurückzuführen. Der Test ist anfällig für Störungen der Lumineszenz, darunter Bakterienverluste durch andere Effekte als Toxizität, wie z. B. Filtration der Probe, Lichtabsorption aufgrund der Farbe und Lichtstreuung durch Trübung . ^{[ 16 ]} Korrekturen können durch die Untersuchung einer Probe mit ähnlicher Partikelzusammensetzung vorgenommen werden, die bekanntermaßen nicht toxisch ist. Der Test umfasst zwei Kontrollen und 13 Probenverdünnungen in Doppelbestimmung. ^{[ 16 ]} Der Festphasentest exponiert die Bakterien auf eine Weise, die mit Porenwasser und Eluat nicht immer möglich ist. ^{[ 12 ]}

Akute Toxizitätsvergleichs- und Hemmtests sind die besten Verfahren zur Untersuchung von Proben mit geringer Toxizität, wenn mit dem Basistest kein ECxx-Wert bestimmt werden kann. ^{[ 17 ]} Diese Protokolle werden für die Untersuchung von Abwasser aus Kläranlagen , Regenwasserabfluss , Trinkwasser , Porenwasser und Eluat empfohlen. ^{[ 17 ]} Bei diesen Tests werden mehrere Replikate einer Probe in einer einzigen Konzentration verwendet. Ähnlich wie beim Basistest werden beim Vergleichstest Nullzeit-Lichtmessungen zur Korrektur der zeitabhängigen Lichtmessungen verwendet. Der Hemmtest verwendet keine Nullzeit-Lichtmessungen und kann daher keinen Korrekturfaktor für die zeitabhängigen Lichtmessungen verwenden. Beide Tests umfassen fünf Kontrollen und fünf Replikate der Probe in einer einzigen Konzentration. ^{[ 17 ]}

Die von Azur Environmental entwickelte Software Microtox Omni ermöglicht es Anwendern des Microtox-Analysegeräts Modell 500, Tests durchzuführen, Daten zu visualisieren, Statistiken zu berechnen und Berichte zu erstellen. ^{[ 18 ]} Das Programm enthält Vorlagen für alle gängigen Toxizitätstests und erlaubt deren Anpassung und Erweiterung. Durch die Anpassung der Vorlagen lassen sich neue Testformate erstellen, die ursprünglich nicht in der Software enthalten waren. ^{[ 18 ]} Die in der Software enthaltenen Testvorlagen definieren alle Parameter für eine bestimmte Testmethode . Das Programm berechnet die effizienteste Einrichtung des gewünschten Tests auf dem Analysegerät Modell 500. Ein Test-Tutor ist ebenfalls in Microsoft Omni enthalten und bietet detaillierte Anweisungen zur Einrichtung und Durchführung des jeweiligen Tests. ^{[ 18 ]} Die Software ermöglicht das Laden von Dateien aus früheren Versionen der Microtox-DOS-Software und das Speichern neuer Daten im Originalformat. Die Software beinhaltet eine Datenbank , die Nutzern Zugriff auf Daten anderer Nutzer und Teststandorte ermöglicht und so den Vergleich von Daten und Trendveränderungen im Zeitverlauf erlaubt. Microtox Omni ist mit beliebig vielen Datenbanken kompatibel . ^{[ 18 ]}

Microtox findet vielfältige Anwendung im Umwelt- und Industriebereich. Häufige Einsatzgebiete sind die Prüfung der Toxizität von Meer- und Süßwasser sowie von Sedimenten auf Pestizide und andere anorganische und organische Chemikalien.

Trinkwasser: Microtox wird zur Untersuchung von Trinkwasserquellen in vielen Gebieten eingesetzt, in denen eine versehentliche oder vorsätzliche Verunreinigung möglich ist. Toxische Verunreinigungen im Trinkwasser werden durch eine Veränderung der Farbe oder Lichtintensität oder durch eine Veränderung der Sauerstoffverbrauchsrate angezeigt. ^{[ 8 ]}

Seen und Flüsse: Microtox wird zur Prüfung der Toxizität von See- und Flusssedimenten eingesetzt, die mit Metallen oder unspezifischen Schadstoffen kontaminiert sind. Für Sedimente wird der Festphasentest verwendet, während für Porenwasser entweder der Basistest oder der 100%-Test zum Einsatz kommt. ^{[ 12 ]}

Sedimentuntersuchungen: Microtox wird zur Prüfung und Bewertung der Toxizität verschiedener mariner und Süßwassersedimente eingesetzt, die mit Metallen und organischen Stoffen kontaminiert sind. Wässrige Extrakte kontaminierter Böden, Bohrschlämme und Klärschlamm werden verwendet. Die Microtox-Daten können zur Festlegung von Schwellenwerten für die scheinbare Wirkung (Apparent Effects Threshold, AET), von Sedimentqualitätsstandards und für NPDES- Genehmigungen sowie für Sanierungsziele im Rahmen des Superfund-Programms herangezogen werden. ^{[ 12 ]}

Industriell: Dieser Bioassay dient der Beurteilung der Toxizität komplexer industrieller Abwasserquellen. Er ist eine kostengünstige Methode zur Überwachung und Prüfung einer großen Anzahl von Proben. Microtox kann auch als Frühwarnsystem (EWS) eingesetzt werden und hilft beim Nachweis toxischer Stoffe sowie bei der Vorhersage der Ergebnisse anderer Bioassays und Tests. ^{[ 19 ]}

Microtox wurde auch in Tierversuchen als In-vitro- Alternative eingesetzt.

Zahlreiche Studien und veröffentlichte Daten, die Microtox-Ergebnisse mit Toxizitätswerten für Fische, Krebstiere und Algen vergleichen, haben eine positive Korrelation festgestellt. ^{[ 20 ]} Andere Studien weisen jedoch darauf hin, dass der Einfluss der Lichtintensität auf das Überleben von Organismen unbekannt ist. Bedenken wurden auch hinsichtlich der Verwendung von Sedimentextrakten anstelle des Sediments selbst geäußert. Es ist möglich, dass nur wasserlösliche Schadstoffe untersucht werden und daher nicht das gesamte Spektrum der im Sediment vorhandenen Schadstoffe repräsentieren. Extrakte können zudem nicht bioverfügbare Schadstoffe entfernen. Dies könnte zu einer Über- oder Unterschätzung der Schadstoffe und ihrer biologischen Wirkungen führen. ^{[ 12 ]}