Die retrograde Markierung ist eine Forschungsmethode in den Neurowissenschaften , mit der neuronale Verbindungen von ihrem Endpunkt (der Synapse ) zu ihrem Ursprung (dem Zellkörper ) verfolgt werden können. Retrograde Markierungstechniken ermöglichen eine detaillierte Untersuchung neuronaler Verbindungen zwischen einer Zielpopulation von Neuronen und ihren Eingängen im gesamten Nervensystem . Diese Techniken erlauben die Kartierung von Verbindungen zwischen Neuronen in einer bestimmten Struktur (z. B. dem Auge ) und den Zielneuronen im Gehirn . Die entgegengesetzte Technik ist die anterograde Markierung , mit der neuronale Verbindungen von ihrem Ursprung zu ihrem Endpunkt (d. h. vom Zellkörper zur Synapse) verfolgt werden. Beide Markierungstechniken basieren auf der Visualisierung des axonalen Transports .
Techniken
Die retrograde Markierung kann auf verschiedene Weise erfolgen, unter anderem durch die Verwendung von Virusstämmen als Marker für die Verbindung einer Zelle mit der Injektionsstelle. Das Pseudorabiesvirus (PRV; Bartha-Stamm) eignet sich beispielsweise als Tracer, da sich die Infektion entlang synaptisch verknüpfter Neuronen stromaufwärts ausbreitet und so die Struktur ihrer Schaltkreise offenlegt. [ 1 ] [ 2 ]
Tollwut hat sich für dieses System der Schaltkreisverfolgung als effektiv erwiesen, da sie nur geringe Schäden an infizierten Zellen verursacht, spezifisch nur Neuronen infiziert und die Virusausbreitung zwischen Neuronen und synaptischen Regionen streng begrenzt. [ 3 ] Diese Faktoren ermöglichen hochspezifische Spuren, die einzelne neuronale Verbindungen in einem Schaltkreis sichtbar machen können, ohne die Zellen physisch zu schädigen.
Eine weitere Technik besteht darin, spezielle „Kügelchen“ in die Hirnkerne narkotisierter Tiere zu injizieren . [ 4 ] Die Tiere überleben einige Tage und werden dann eingeschläfert. Die Zellen im Ursprung der Projektion werden mithilfe eines inversen Fluoreszenzmikroskops sichtbar gemacht .
Wickersham und Kollegen entwickelten eine spezielle Technik, bei der ein modifiziertes Tollwutvirus zum Einsatz kam . Dieses Virus war in der Lage, eine einzelne Zelle zu infizieren und eine Synapse zu überspringen; dies ermöglichte es den Forschern, die lokale Vernetzung von Neuronen zu untersuchen. [ 5 ]
Tollwutvirus
Nach der Aufnahme am synaptischen Terminal oder Axon des Zielneurons wird das Tollwutvirus in ein Vesikel verpackt , das über axonales Dynein zum Zellkörper transportiert wird . Beim Wildtyp- Tollwutvirus vermehrt sich das Virus und breitet sich im gesamten zentralen Nervensystem aus, bis es das gesamte Gehirn systemisch infiziert hat. [ 3 ] Die Deletion des Gens, das für das Glykoprotein (G-Protein) kodiert, beschränkt die Ausbreitung des Tollwutvirus auf die ursprünglich infizierten Zellen. Die transsynaptische Ausbreitung des Virus kann durch Pseudotypisierung des G-Proteins und die Cre -Kontrolle des Gens auf die monosynaptische Übertragung auf das Ursprungsneuron beschränkt werden. Diese Virusausbreitung kann durch verschiedene Methoden visualisiert werden, beispielsweise durch die Anlagerung eines Fluoreszenzgens, wie etwa des grün fluoreszierenden Proteins ( GFP) , an die Viruskassette oder durch Immunhistochemie . [ 6 ] [ 7 ]
Pseudorabiesvirus
Als Mitglied der Familie der Herpesviren breitet sich das Pseudorabiesvirus (Pseudorabiesvirus ) im ZNS sowohl retrograd als auch anterograd aus. Bei der retrograden Ausbreitung wandert es entlang des Axons in den Soma und die Dendriten. Die Deletion dreier wichtiger Membranproteingene im PRV-Bartha-Stamm des Pseudorabiesvirus blockiert die anterograde Ausbreitung und ermöglicht weitere Modifikationen der viralen DNA, wie beispielsweise das Hinzufügen von Fluoreszenz, wodurch die retrograde Ausbreitung verfolgt werden kann. [ 8 ]
Fluoro-Gold
Fluoro-Gold, auch bekannt als Hydroxystilbamidin , ist ein nicht-viraler, fluoreszierender, retrograder Tracer, dessen Bewegung entlang des Axons und durch den Dendritenbaum mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Immunhistochemie visualisiert werden kann. [ 9 ]
Siehe auch
Referenzen
- O'Donnell , P.; Lavín, A.; Enquist, LW; Grace, AA; Card, JP (1997). „Vernetzte parallele Schaltkreise zwischen Nucleus accumbens und Thalamus der Ratte , aufgedeckt durch retrograden transsynaptischen Transport des Pseudorabiesvirus“ . Journal of Neuroscience . 17 (6): 2143–2167 . doi : 10.1523/jneurosci.17-06-02143.1997 . PMC 6793770. PMID 9045740 .
- ^ Luo, AH; Aston-Jones, G. (2009). „Schaltkreisprojektion vom Nucleus suprachiasmaticus zum ventralen Tegmentum: ein neuartiger zirkadianer Ausgabepfad“ . European Journal of Neuroscience . 29 (4): 748–760 . doi : 10.1111/j.1460-9568.2008.06606.x . PMC 3649071. PMID 19200068 .
- ^ a b Davis, Benjamin M.; Rall, Glenn F.; Schnell, Matthias J. (06.11.2015). „Alles, was Sie schon immer über das Tollwutvirus wissen wollten (aber sich nicht zu fragen trauten)“ . Annual Review of Virology . 2 (1): 451–71 . doi : 10.1146/annurev-virology-100114-055157 . PMC 6842493. PMID 26958924 .
- Katz , LC; Burkhalter, A.; Dreyer, WJ (9. August 1984). „Fluoreszierende Latex-Mikrokügelchen als retrograder neuronaler Marker für In-vivo- und In-vitro-Studien des visuellen Kortex“. Nature . 310 ( 5977): 498–500 . Bibcode : 1984Natur.310..498K . doi : 10.1038/310498a0 . PMID 6205278. S2CID 36191957 .
- ^ Wickersham IR, Lyon DC, Barnard RJ, et al. (März 2007). „Monosynaptische Beschränkung der transsynaptischen Markierung von einzelnen, genetisch markierten Neuronen“ . Neuron . 53 ( 5): 639–47 . doi : 10.1016/j.neuron.2007.01.033 . PMC 2629495. PMID 17329205 .
- ^ TotalBoox; TBX (2011-01-01). Forschungsfortschritte bei Tollwut . Elsevier Science. ISBN 978-0-12-387041-4OCLC 968996286 .
- ^ Huang, Z. Josh; Zeng, Hongkui (10.07.2013). „Genetische Ansätze zur Untersuchung neuronaler Schaltkreise in der Maus“. Annual Review of Neuroscience . 36 : 183–215 . doi : 10.1146/annurev-neuro-062012-170307 . PMID 23682658 .
- ^ Enquist, LW (1. Dezember 2002). „Nutzung der schaltkreisspezifischen Ausbreitung des Pseudorabiesvirus im Zentralnervensystem: Erkenntnisse zur Pathogenese und Schaltkreismarker“ . The Journal of Infectious Diseases . 186 (Supplement_2): S209– S214. doi : 10.1086/344278 . ISSN 0022-1899 . PMID 12424699 .
- Naumann , T.; Härtig, W.; Frotscher, M. (15.11.2000). „Retrograde Markierung mit Fluoro-Gold: Verschiedene Methoden des Tracernachweises auf ultrastruktureller Ebene und neurodegenerative Veränderungen von rückgefüllten Neuronen in Langzeitstudien“. Journal of Neuroscience Methods . 103 (1): 11–21 . doi : 10.1016 / s0165-0270(00)00292-2 . ISSN 0165-0270 . PMID 11074092. S2CID 24155326 .
Weiterführende Literatur
Die retrograde Markierung wurde in einer Vielzahl neurowissenschaftlicher Studien umfassend eingesetzt, darunter beispielsweise in den folgenden Beispielen:
- Song, Chenghui; Ehlers, Vanessa L.; Moyer, James R. (30.09.2015). „Spurenkonditionierung moduliert differenziell die intrinsische Erregbarkeit von Projektionsneuronen des medialen präfrontalen Kortex und des basolateralen Amygdala-Komplexes im infralimbischen und prälimbischen Kortex“ . Journal of Neuroscience . 35 (39): 13511–13524 . doi : 10.1523/JNEUROSCI.2329-15.2015 . ISSN 0270-6474 . PMC 4588614. PMID 26424895 .
- Bácskai, Tímea; Rusznák, Zoltán; Paxinos, George; Watson, Charles (01.01.2014). „Muskulotopische Organisation der Motoneuronen, die die Hinterbeinmuskulatur der Maus versorgen: eine quantitative Studie mittels Fluoro-Gold-Retrograde-Markierung“. Brain Structure and Function . 219 (1): 303–321 . doi : 10.1007/s00429-012-0501-7 . hdl : 20.500.11937/26565 . ISSN 1863-2653 . PMID 23288256. S2CID 17675285 .
- Schwarz, Lindsay A.; Miyamichi, Kazunari; Gao, Xiaojing J.; Beier, Kevin T.; Weissbourd, Brandon; DeLoach, Katherine E.; Ren, Jing; Ibanes, Sandy; Malenka, Robert C. (2015). „Viralgenetische Untersuchung der Input-Output-Organisation eines zentralen Noradrenalin-Schaltkreises“ . Nature . 524 ( 7563): 88–92 . Bibcode : 2015Natur.524...88S . doi : 10.1038/nature14600 . PMC 4587569. PMID 26131933 .
- Ohara, Shinya; Sato, Sho; Tsutsui, Ken-Ichiro; Witter, Menno P.; Iijima, Toshio (06.11.2013). „Organisation multisynaptischer Eingänge zum dorsalen und ventralen Gyrus dentatus: Retrograde transsynaptische Markierung mit einem Tollwutvirusvektor in der Ratte“ . PLOS ONE . 8 (11) e78928. Bibcode : 2013PLoSO...878928O . doi : 10.1371 /journal.pone.0078928 . ISSN 1932-6203 . PMC 3819259. PMID 24223172 .
- DeNardo, Laura A.; Berns, Dominic S.; DeLoach, Katherine; Luo, Liqun (2015). „Konnektivität des somatosensorischen und präfrontalen Kortex der Maus untersucht mittels transsynaptischer Markierung“ . Nature Neuroscience . 18 (11): 1687–1697 . doi : 10.1038/nn.4131 . PMC 4624522. PMID 26457553 .
