Die virale neuronale Markierung nutzt Viren , um neuronale Verbindungen zu verfolgen und so einen sich selbst replizierenden Tracer bereitzustellen . Viren bieten gegenüber molekularen Tracern den Vorteil der Selbstreplikation, können sich aber auch zu schnell ausbreiten und Nervengewebe schädigen. Viren, die das Nervensystem infizieren können – sogenannte neurotrope Viren –, breiten sich über Synapsen in räumlich eng beieinander liegenden Neuronenverbänden aus und eignen sich daher zur Untersuchung funktionell vernetzter neuronaler Netzwerke. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]

Die Verwendung von Viren zur Markierung funktionell verbundener Neuronen geht auf die Arbeiten und den von Albert Sabin entwickelten Bioassay zurück . [ 4 ] Weiterführende Forschungen ermöglichten die Integration immunhistochemischer Techniken zur systematischen Markierung neuronaler Verbindungen. [ 4 ] Bis heute wurden Viren zur Untersuchung verschiedener Schaltkreise im Nervensystem eingesetzt.

Neuronale Kartographie

Die einzelnen Verbindungen von Neuronen stellten lange ein Rätsel für Neuroanatomen dar . [ 5 ] Neuronale Markierungsmethoden ermöglichen einen beispiellosen Einblick in die Morphologie und Vernetzung neuronaler Netzwerke. Je nach verwendetem Tracer kann sich die Markierung auf ein einzelnes Neuron beschränken oder transsynoptisch auf benachbarte Neuronen ausbreiten. Nach ausreichender Ausbreitung des Tracers lässt sich das Ausmaß entweder mittels Fluoreszenz (bei Farbstoffen) oder mittels Immunhistochemie (bei biologischen Tracern) messen. Eine wichtige Innovation auf diesem Gebiet ist die Verwendung neurotroper Viren als Tracer. Diese breiten sich nicht nur am ursprünglichen Infektionsort aus, sondern können auch Synapsen überspringen .

Viruslebenszyklus

Der Lebenszyklus von Viren, wie sie beispielsweise beim neuronalen Tracing verwendet werden, unterscheidet sich von dem zellulärer Organismen . Viren sind Parasiten und können sich nicht selbstständig vermehren. Daher müssen sie einen anderen Organismus infizieren und dessen Zellmaschinerie nutzen, um ihren Lebenszyklus zu vollenden.

Die erste Phase des viralen Lebenszyklus wird als Viruseintritt bezeichnet . Sie beschreibt, wie ein Virus eine neue Wirtszelle infiziert. In der Natur werden neurotrope Viren üblicherweise durch Bisse oder Kratzer übertragen, wie beispielsweise das Tollwutvirus oder bestimmte Herpesviren . In Tracerstudien wird dieser Schritt künstlich herbeigeführt, typischerweise mithilfe einer Spritze. Die nächste Phase des viralen Lebenszyklus heißt Virusreplikation . In dieser Phase übernimmt das Virus die Zellmaschinerie der Wirtszelle, um die Zelle zur Produktion weiterer Virusproteine ​​und zur Bildung neuer Viren zu veranlassen.

Sobald die Zelle eine ausreichende Anzahl von Viren produziert hat, tritt das Virus in die Virusausscheidungsphase ein . In dieser Phase verlassen die Viren die ursprüngliche Wirtszelle und suchen nach einem neuen Wirt. Bei neurotropen Viren findet diese Übertragung typischerweise an der Synapse statt . Viren können über eine relativ kurze Distanz von einem Neuron zum nächsten springen. Diese Eigenschaft macht Viren so nützlich für Tracerstudien.

Sobald das Virus in die nächste Zelle eindringt, beginnt der Zyklus von neuem. Die ursprüngliche Wirtszelle beginnt nach der Ausscheidungsphase zu degenerieren. Aus diesem Grund muss in Tracerstudien der Zeitpunkt genau kontrolliert werden. Breitet sich das Virus zu weit aus, wird die ursprüngliche Mikrostruktur, die von Interesse ist, abgebaut, und es können keine verwertbaren Informationen gewonnen werden. Viren können typischerweise nur wenige Organismen infizieren, und selbst dann nur einen bestimmten Zelltyp im Körper. Die Spezifität eines bestimmten Virus für ein bestimmtes Gewebe wird als sein Tropismus bezeichnet . Die Viren in Tracerstudien sind alle neurotrop (sie können Neuronen infizieren). [ 6 ]

Methoden

Infektion

Der virale Tracer kann in periphere Organe wie Muskeln oder Drüsen eingebracht werden . [ 7 ] Bestimmte Viren, wie beispielsweise das Adeno-assoziierte Virus (AAV) , können in die Blutbahn injiziert werden und die Blut-Hirn-Schranke überwinden, um das Gehirn zu infizieren. [ 8 ] Er kann auch in ein Ganglion eingebracht oder mithilfe eines stereotaktischen Geräts direkt ins Gehirn injiziert werden . Diese Methoden ermöglichen einzigartige Einblicke in die Verbindungen zwischen Gehirn und Peripherie.

Viren werden auf vielfältige Weise in neuronales Gewebe eingebracht. Es gibt zwei Hauptmethoden, um Tracer in das Zielgewebe einzubringen.

  1. Bei der Druckinjektion muss der Tracer in flüssiger Form direkt in die Zelle injiziert werden. Dies ist die gebräuchlichste Methode.
  2. Bei der Iontophorese wird an eine Tracerlösung innerhalb einer Elektrode ein elektrischer Strom angelegt. Die Tracermoleküle nehmen eine Ladung auf und werden durch das elektrische Feld in die Zelle transportiert. Dies ist eine nützliche Methode, wenn die Zelle nach der Patch-Clamp- Technik markiert werden soll. [ 9 ]

Sobald der Tracer in die Zelle eingebracht wird, greifen die zuvor genannten Transportmechanismen. Anschließend infiziert das Virus nach dem Eindringen in das Nervensystem Zellen in der Umgebung. Die Viren funktionieren, indem sie ihr eigenes genetisches Material in das Genom der infizierten Zellen integrieren. [ 10 ] Die Wirtszelle produziert dann die vom Gen kodierten Proteine. Forscher können zahlreiche Gene in die infizierten Neuronen einbringen, darunter auch fluoreszierende Proteine ​​zur Visualisierung. [ 10 ] Weitere Fortschritte beim neuronalen Tracing ermöglichen die gezielte Expression fluoreszierender Proteine ​​in spezifischen Zelltypen. [ 10 ]

Histologie und Bildgebung

Sobald sich das Virus im gewünschten Ausmaß ausgebreitet hat, wird das Gehirn in Scheiben geschnitten und auf Objektträger aufgebracht. Anschließend werden fluoreszierende Antikörper , die entweder spezifisch für das Virus sind, oder fluoreszierende komplementäre DNA- Sonden für virale DNA über die Schnitte gewaschen und unter einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet . [ 9 ]

Übertragungsrichtung

Die Virusübertragung beruht auf dem Mechanismus des axoplasmatischen Transports . Im Axon befinden sich lange, schlanke Proteinkomplexe, die sogenannten Mikrotubuli . Sie dienen als Zytoskelett und tragen zur Formstabilität der Zelle bei. Darüber hinaus fungieren sie als Transportwege innerhalb des Axons und ermöglichen den Transport von Neurotransmitter- gefüllten Vesikeln und Enzymen zwischen Zellkörper ( Soma) und Axonterminal ( Synapse) .

Viren können in zwei Richtungen transportiert werden: entweder anterograd (vom Soma zur Synapse) oder retrograd (von der Synapse zum Soma). Neuronen transportieren natürlicherweise Proteine , Neurotransmitter und andere Makromoleküle über diese zellulären Transportwege. Neuronale Tracer, darunter auch Viren, nutzen diese Transportmechanismen, um einen Tracer in der Zelle zu verteilen. Forscher können dies zur Untersuchung synaptischer Schaltkreise verwenden.

Anterograder Transport

Bei der anterograden Markierung wird ein Tracer verwendet, der sich vom Soma zur Synapse bewegt. Der anterograde Transport nutzt ein Protein namens Kinesin , um Viren entlang des Axons in anterograder Richtung zu transportieren. [ 9 ]

Retrograder Transport

Bei der retrograden Markierung wird ein Tracer verwendet, der sich von der Synapse zum Soma bewegt. Der retrograde Transport nutzt das Protein Dynein , um Viren entlang des Axons in retrograder Richtung zu transportieren. [ 9 ] [ 11 ] Es ist wichtig zu beachten, dass verschiedene Tracer charakteristische Affinitäten zu Dynein und Kinesin aufweisen und sich daher unterschiedlich schnell ausbreiten.

Doppelter Transport

Manchmal ist es wünschenswert, Neuronen stromaufwärts und stromabwärts zu verfolgen, um sowohl die Eingänge als auch die Ausgänge neuronaler Schaltkreise zu bestimmen. Dies nutzt eine Kombination der oben genannten Mechanismen. [ 12 ]

Vor- und Nachteile

Vorteile

Ein Vorteil der Verwendung viraler Tracer ist die Fähigkeit des Virus, Synapsen zu überspringen. Dies ermöglicht die Verfolgung von Mikroschaltkreisen sowie Projektionsstudien. Nur wenige molekulare Tracer sind dazu in der Lage, und diejenigen, die es können, zeigen meist ein abgeschwächtes Signal in sekundären Neuronen. Dies führt zu einem weiteren Vorteil der viralen Tracer-Technologie: Viren können sich selbst replizieren. Sobald ein sekundäres Neuron infiziert ist, beginnt sich das Virus zu vermehren. Es kommt zu keinem Signalverlust, während sich der Tracer im Gehirn ausbreitet. [ 6 ]

Nachteile

Während sich Viren im Nervensystem ausbreiten, infizieren die viralen Tracer Neuronen und zerstören diese schließlich. Daher muss der Zeitpunkt von Tracerstudien präzise gewählt werden, um eine ausreichende Ausbreitung zu ermöglichen, bevor es zum neuronalen Zelltod und damit zu großflächigen Schäden im Körper kommt. [ 13 ]

Es war schwierig, Viren zu finden, die sich optimal für diese Aufgabe eignen. Ein Virus, das zur Kontaktverfolgung eingesetzt wird, sollte idealerweise nur schwach infektiös sein, um gute Ergebnisse zu liefern, aber nicht tödlich, sodass es Nervengewebe zu schnell zerstört oder unnötige Risiken für die exponierten Personen birgt.

Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass die virale neuronale Markierung derzeit den zusätzlichen Schritt erfordert, fluoreszierende Antikörper an die Viren zu binden, um deren Verlauf sichtbar zu machen. Im Gegensatz dazu sind die meisten molekularen Tracer leuchtend gefärbt und können ohne weitere Modifikation mit bloßem Auge betrachtet werden.

Aktuelle Verwendungen

Die virale Markierung dient primär der Verfolgung neuronaler Schaltkreise. Forscher nutzen eines der zuvor genannten Viren, um die Vernetzung der Neuronen im Gehirn detailliert zu untersuchen. [ 14 ] Diese Vernetzung bestimmt maßgeblich die Gehirnfunktion. Viren wurden unter anderem zur Untersuchung von retinalen Ganglienschaltkreisen [ 15 ] , kortikalen Schaltkreisen [ 16 ] und spinalen Schaltkreisen eingesetzt.

Viren im Einsatz

Nachfolgend eine Liste der Viren, die derzeit zum Zweck der neuronalen Verfolgung verwendet werden.

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