Elektroneneinfangdissoziation

Die Elektroneneinfangdissoziation ( ECD ) ist eine Methode zur Fragmentierung von Gasphasenionen für die Strukturaufklärung von Peptiden und Proteinen in der Tandem-Massenspektrometrie . Sie ist eine der am weitesten verbreiteten Techniken zur Aktivierung und Dissoziation massenselektierter Vorläuferionen in der MS/MS. Dabei werden Gasphasenionen direkt mit niederenergetischen Elektronen angereichert. ^{[ 1 ] [ 2 ]}

Die Elektroneneinfangdissoziation wurde von Roman Zubarev und Neil Kelleher im Labor von Fred McLafferty an der Cornell University entwickelt . Die Bestrahlung von Melittin⁴⁺- und Ubiquitin¹⁰⁺-Ionen (gefangen in einer FT-MS-Zelle) mit Laserpulsen führte nicht nur zu einer ungewöhnlichen c',z-Fragmentierung, sondern auch zu einer Ladungsreduktion. Es wurde vermutet, dass durch die Modifizierung der FT-Zelle zur gleichzeitigen Einfangung von Kationen und Elektronen die von UV-Photonen emittierten Sekundärelektronen den Ladungsreduktionseffekt und die c',z•-Fragmentierung verstärken. Der Ersatz des UV-Lasers durch eine EI-Quelle führte zur Entwicklung dieser neuen Technik. ^{[ 3 ]}

Bei der Elektroneneinfangdissoziation wechselwirkt typischerweise ein mehrfach protoniertes Molekül M mit einem freien Elektron und bildet ein Ion mit ungerader Elektronenzahl. Die Freisetzung der elektrischen Potenzialenergie führt zur Fragmentierung des Produktiones.

${\displaystyle [{\ce {M}}+n{\ce {H}}]^{n+}+{\ce {e^- ->}}{\bigg [}[{\ce {M}}+n{\ce {H}}]^{(n-1)+}{\bigg ]}^{*}{\ce {-> Fragmente}}}$Die

Die Dissoziationsrate von Elektroneneinfangreaktionen hängt nicht nur von der Häufigkeit der Ion-Elektron-Fragmentierungsreaktionen ab, sondern auch von der Anzahl der Ionen im Ion-Elektron-Wechselwirkungsvolumen. Die Elektronenstromdichte und der Wirkungsquerschnitt der ECD sind direkt proportional zur Fragmentierungsfrequenz. ^{[ 4 ] [ 5 ]} Eine indirekt beheizte Dispenserkathode, die als Elektronenquelle dient, führt zu einem höheren Elektronenstrom und einer größeren emittierenden Oberfläche. ^{[ 6 ] [ 7 ]}

${\displaystyle {\text{Effizienz von ECD MS/MS}}={\frac {\text{Gesamtzahl (Häufigkeit) der Fragmentionen}}{\text{Gesamtzahl (Häufigkeit) der Vorläuferionen}}}}$

ECD-Geräte können in zwei Formen vorliegen. Sie können Analytionen während der ECD-Phase einfangen oder im Durchflussmodus arbeiten, bei dem die Dissoziation stattfindet, während die Analytionen kontinuierlich durch den ECD-Bereich strömen. Der Durchflussmodus bietet gegenüber dem anderen Modus den Vorteil, dass nahezu der gesamte Analytionenstrahl genutzt wird. Dies verringert jedoch die Effizienz des ECD im Durchflussmodus. ^{[ 8 ]}

Die ECD erzeugt deutlich andere Fragmentionen (hauptsächlich c- und z-Ionen, aber auch b-Ionen wurden in der ECD identifiziert ^{[ 9 ]} ) als andere MS/MS-Fragmentierungsmethoden wie die Elektronenablösungsdissoziation (EDD) (hauptsächlich a- und x-Ionen) ^{[ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]} , die kollisionsinduzierte Dissoziation (CID) (hauptsächlich b- ^{[ 13 ]} und y-Ionen) und die Infrarot-Multiphotonendissoziation ( IRMPD). CID und IRMPD führen auf die eine oder andere Weise interne Schwingungsenergie ein, was zum Verlust posttranslationaler Modifikationen während der Fragmentierung führt. In der ECD werden einzigartige Fragmente (komplementär zu CID) beobachtet ^{[ 14 ]} , und die Möglichkeit, ganze Makromoleküle effektiv zu fragmentieren, ist vielversprechend.

Obwohl ECD primär in der Fourier-Transform-Ionenzyklotronresonanz- Massenspektrometrie eingesetzt wird ^{[ 15 ]} , haben Forscher gezeigt, dass es auch erfolgreich in einem Ionenfalle-Massenspektrometer verwendet wurde ^{[ 16 ] [ 17 ] [ 18 ]} . In Kombination mit externer Akkumulation ermöglicht ECD zudem die schnelle Integration mehrerer Scans in der FTICR-MS ^{[ 6 ] .}

Die Elektronen-Ketten-Dissoziation (ECD) ist eine relativ neue MS/MS-Fragmentierungstechnik, die weiterhin erforscht wird. ^{[ 19 ] [ 20 ]} Der Mechanismus der ECD ist noch nicht vollständig geklärt, scheint aber nicht zwangsläufig die schwächste Bindung zu spalten und wird daher als schneller ( nicht-ergodischer ) Prozess angesehen, bei dem die Energie nicht intramolekular frei frei fließen kann. Es wird vermutet, dass durch Elektronen initiierte Radikalreaktionen für die Wirkung der ECD verantwortlich sein könnten. ^{[ 21 ]} Bei einer ähnlichen MS/MS-Fragmentierungstechnik, der sogenannten Elektronentransferdissoziation , werden die Elektronen durch Kollision zwischen den Analyt-Kationen und den Reagenz-Anionen übertragen. ^{[ 22 ] [ 23 ] [ 24 ]}

ECD itself and combined with other MS is very useful for proteins and peptides containing multiple disulfide bonds. FTICR combined with ECD helps to recognize peptides containing disulfide bonds. ECD could also access important sequence information by activation of higher charged proteins. Moreover, disulfide bond cleavage takes place by ECD of multiply charge proteins or peptides produced by ESI.^[25] Electron capture by these proteins releases H atom, captured by the disulfide bond to cause its dissociation.^[26]

${\displaystyle {\ce {RS-SR'+\bullet H->RS(H)\bullet SR'->RSH{}+\bullet SR'}}}$

ECD with UV-based activation increases the top-down MS sequence coverage of disulfide bond containing proteins and cleaves a disulfide bond homolytically to produce two separated thiol radicals. This technique was observed with insulin and ribonuclease, which led them to cleave up to three disulfide bonds and increase the sequence coverage.^[27]

ECD-MS fragments can retain posttranslational modifications such as carboxylation, phosphorylation^[28][29] and O-glycosylation.^[6][30][31] ECD has the potential to do the top-down characterization of the major types of posttranslational modifications in proteins. It successfully cleaved 87 of 208 backbone bonds and provided the first direct characterization of a phosphoprotein, bovine β casein, simultaneously restricting the location of five phosphorylation sites. It has advantages over CAD to measure the degree of phosphorylation with a minimum number of losses of phosphates and for phosphopeptide/phosphoprotein mapping, which makes ECD a superior technique.^[32]

Die Elektroneneinfangdissoziation (ECD) wurde mit der Kapillarelektrophorese (CE) kombiniert, um Einblicke in die Strukturanalyse von Peptid- und Proteinhydrolysatgemischen zu gewinnen. ^{[ 33 ]} Mikro-HPLC in Kombination mit ECD-FTICR wurde zur Analyse eines Pepsinhydrolysats von Cytochrom c eingesetzt. ^{[ 34 ]} Sequenzmarkierungen wurden durch die Analyse eines Peptid- und Tryptic-Hydrolysats von Rinderserumalbumin mittels LC-ECD-FTICR-MS gewonnen. ^{[ 35 ]} Darüber hinaus liefert LC-ECD-MS/MS längere Sequenzmarkierungen als LC-CID-MS/MS zur Proteinidentifizierung. ^{[ 14 ]} ECD-Geräte mit Hochfrequenz- Quadrupol-Ionenfalle sind relevant für die Hochdurchsatz -Proteomik . ^{[ 36 ] [ 8 ]} In jüngster Zeit etabliert sich die atmosphärische Druck-Elektroneneinfangdissoziation (AP-ECD) als überlegene Technik, da sie als eigenständiges Ionenquellengerät eingesetzt werden kann und keine Modifikation des Hauptinstruments erfordert. ^{[ 37 ] [ 38 ]}

Die Analyse von Proteinen kann entweder mit einem Top-Down- oder einem Bottom-Up- Ansatz erfolgen . Die Top-Down-Analyse liefert jedoch eine bessere Sequenzabdeckung. ^{[ 39 ]} Die Kombination von ECD mit FTICR-MS hat zu der Popularität dieses Ansatzes beigetragen. Sie hat auch geholfen, multiple Modifikationsstellen in intakten Proteinen zu bestimmen. ^{[ 40 ] [ 41 ]} Die native Elektroneneinfangdissoziation (NECD) wurde zur Untersuchung des Cytochrom-c-Dimers ^{[ 42 ]} und kürzlich zur Aufklärung von Eisenbindungskanälen im Pferde-Milzferritin eingesetzt. ^{[ 43 ]}

ECD-Untersuchungen von Polyalkenglykolen, Polyamiden, Polyacrylaten und Polyestern sind hilfreich, um die Zusammensetzung von Polymerproben zu verstehen. Sie haben sich zu einer leistungsstarken Technik entwickelt, um Strukturinformationen über Vorläuferionen während der MS/MS-Analyse synthetischer Polymere zu analysieren. Die Tendenz der ECD zur Spaltung einzelner Bindungen vereinfacht die Interpretation von Produktionenscans und ist somit besonders für die Polymerchemie geeignet. ^{[ 44 ]}

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