Ethidiumbromid

Ethidiumbromid (oder Homidiumbromid , ^{[ 2 ]} Chloridsalz Homidiumchlorid ) ^{[ 3 ] [ 4 ]} ist ein Interkalationsmittel , das häufig als Fluoreszenzfarbstoff ( Nukleinsäurefarbstoff ) in molekularbiologischen Laboren für Techniken wie die Agarose-Gelelektrophorese verwendet wird . Es wird üblicherweise mit EtBr abgekürzt , was auch eine Abkürzung für Bromethan ist . Um Verwechslungen zu vermeiden, verwenden einige Labore die Abkürzung EthBr für dieses Salz. Unter UV-Licht fluoresziert es orange, wobei sich die Fluoreszenz nach Bindung an DNA um fast das 20-Fache verstärkt . Unter dem Namen Homidium wird es seit den 1950er Jahren in der Veterinärmedizin zur Behandlung der Trypanosomiasis bei Rindern eingesetzt . ^{[ 5 ]} Die hohe Rate an Antibiotikaresistenzen macht diese Behandlung in einigen Gebieten unpraktisch, wo stattdessen das verwandte Isometamidiumchlorid verwendet wird. Trotz seines Rufs als Mutagen haben Tests gezeigt, dass es ohne metabolische Aktivierung eine geringe Mutagenität aufweist. ^{[ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]}

Wie die meisten fluoreszierenden Verbindungen ist Ethidiumbromid aromatisch . Sein heterocyclischer Grundbaustein ist allgemein als Phenanthridin bekannt , dessen Isomer der fluoreszierende Farbstoff Acridin ist . Die Absorptionsmaxima von EtBr in wässriger Lösung liegen bei 210 nm und 285 nm und entsprechen ultraviolettem Licht . Infolge dieser Anregung emittiert EtBr orangefarbenes Licht mit einer Wellenlänge von 605 nm. ^{[ 9 ] [ 10 ]}

Ethidium bromide's intense fluorescence after binding with DNA is probably not due to rigid stabilization of the phenylmoiety, because the phenyl ring has been shown to project outside the intercalated bases. In fact, the phenyl group is found to be almost perpendicular to the plane of the ring system, as it rotates about its single bond to find a position where it will impinge upon the ring system minimally. Instead, the hydrophobic environment found between the base pairs is believed to be responsible. By moving into this hydrophobic environment and away from the solvent, the ethidium cation is forced to shed any water molecules that were associated with it. As water is a highly efficient fluorescence quencher, the removal of these water molecules allows the ethidium to fluoresce.

Ethidium bromide is commonly used to detect nucleic acids in molecular biology laboratories. In the case of DNA this is usually double-stranded DNA from PCRs, restriction digests, etc. Single-stranded RNA can also be detected, since it usually folds back onto itself and thus provides local base pairing for the dye to intercalate. Detection typically involves a gel containing nucleic acids placed on or under an ultraviolet lamp. Since ultraviolet light is harmful to eyes and skin, gels stained with ethidium bromide are usually viewed indirectly using an enclosed camera, with the fluorescent images recorded as photographs. Where direct viewing is needed, the viewer's eyes and exposed skin should be protected. In the laboratory the intercalating properties have long been used to minimize chromosomal condensation when a culture is exposed to mitotic arresting agents during harvest. The resulting slide preparations permit a higher degree of resolution, and thus more confidence in determining structural integrity of chromosomes upon microscopic analysis.

Ethidiumbromid wird auch bei der Trennung von DNA-Fragmenten mittels Agarose-Gelelektrophorese eingesetzt . ^{[ 11 ]} Es wird dem Laufpuffer zugesetzt und bindet durch Interkalation zwischen die DNA-Basenpaare. Bei der Belichtung des Agarosegels mit UV-Licht werden die DNA-Banden sichtbar. Die Interkalation von EtBr kann Eigenschaften des DNA-Moleküls wie Ladung, Gewicht, Konformation und Flexibilität verändern. Da die Mobilität der DNA-Moleküle im Agarosegel relativ zu einem Molekulargewichtsstandard gemessen wird, können die Effekte von EtBr für die Bestimmung der Molekülgröße entscheidend sein. ^{[ 12 ]}

Ethidiumbromid wird auch häufig zur Reduktion der mitochondrialen DNA -Kopienzahl in proliferierenden Zellen eingesetzt. ^{[ 13 ]} In der Veterinärmedizin wird die Wirkung von EtBr auf die mitochondriale DNA zur Behandlung der Trypanosomiasis bei Rindern genutzt, da EtBr an Moleküle der Kinetoplastiden -DNA bindet und deren Konformation in die Z-DNA- Form verändert. Diese Form hemmt die Replikation der Kinetoplastiden-DNA, was für Trypanosomen letal ist. ^{[ 14 ]}

Das Chloridsalz Homidiumchlorid hat die gleichen Anwendungsgebiete. ^{[ 3 ] [ 4 ]}

Ethidiumbromid kann YPD -Medien zugesetzt und als Hemmstoff für das Zellwachstum verwendet werden. ^{[ 15 ]}

Die Bindungsaffinität der kationischen Nanopartikel zu DNA konnte durch kompetitive Bindung mit Ethidiumbromid bestimmt werden. ^{[ 16 ] [ 17 ]}

EtBr kann sowohl Proteine ​​als auch Nukleinsäuren anfärben. ^{[ 18 ]}

Es gibt Alternativen zu Ethidiumbromid, die als weniger gefährlich und leistungsfähiger beworben werden. ^{[ 19 ] [ 20 ]} Beispielsweise verwenden einige Forscher verschiedene SYBR- basierte Farbstoffe, und es gibt weitere neuartige Farbstoffe wie „Novel Juice“. SYBR-Farbstoffe sind im Ames-Test mit Leberextrakt weniger mutagen als Ethidiumbromid. ^{[ 21 ]} Allerdings erwies sich SYBR Green I in UV-bestrahlten Bakterienzellen (die zur Visualisierung beider Farbstoffe verwendet werden) als mutagener als Ethidiumbromid. ^{[ 22 ]} Dies mag auch für andere „sicherere“ Farbstoffe zutreffen, doch obwohl Daten zu Mutagenität und Toxizität vorliegen ^{[ 23 ],} _wurden diese nicht in Fachzeitschriften mit Peer-Review veröffentlicht. Das Sicherheitsdatenblatt für SYBR Safe gibt eine LD50 für Ratten von über 5 g/kg an, die höher ist als die von Ethidiumbromid (1,5 g/kg). Viele alternative Farbstoffe sind in DMSO suspendiert , was eigene gesundheitliche Risiken birgt, darunter eine erhöhte Aufnahme organischer Verbindungen über die Haut. ^{[ 21 ]} Trotz der Leistungsvorteile von SYBR-Farbstoffen gegenüber EtBr für Färbezwecke bevorzugen viele Forscher weiterhin EtBr, da es deutlich kostengünstiger ist.

Die meisten im Labor verwendeten Ethidiumbromid-Konzentrationen (0,25–1 μg/ml) liegen unterhalb der LD50-Dosis, wodurch eine akute Toxizität unwahrscheinlich ist. Um das Langzeitrisiko von Ethidiumbromid für Laborpersonal vollständig zu verstehen, wären Tests am Menschen und Langzeitstudien an Säugetieren erforderlich. Es ist jedoch bekannt, dass Ethidiumbromid Mutationen in Säugetier- und Bakterienzellen verursachen kann. ^{[ 24 ]}

Ethidiumbromid unterliegt in niedrigen Konzentrationen keiner Regulierung als gefährlicher Abfall ^{[ 25 ]} , wird aber von vielen Organisationen als solcher behandelt. Der Umgang mit dem Material sollte gemäß dem Sicherheitsdatenblatt des Herstellers erfolgen .

Die Entsorgung von Ethidiumbromid aus Laboren ist weiterhin umstritten. ^{[ 26 ]} Ethidiumbromid kann chemisch abgebaut oder gesammelt und verbrannt werden. Üblicherweise wird Ethidiumbromid unterhalb einer vorgeschriebenen Konzentration normal entsorgt (z. B. durch Ausgießen in den Abfluss). Eine gängige Praxis ist die Behandlung von Ethidiumbromid mit Natriumhypochlorit (Bleichmittel) vor der Entsorgung. ^{[ 27 ]} Laut Lunn und Sansone entstehen bei der chemischen Zersetzung mit Bleichmittel Verbindungen, die im Ames-Test mutagen wirken . Es fehlen Daten zu den mutagenen Wirkungen der Abbauprodukte. Lunn und Sansone beschreiben effektivere Abbaumethoden. ^{[ 28 ]} Andernorts wird die Entfernung von Ethidiumbromid aus Lösungen mit Aktivkohle oder Ionenaustauscherharz empfohlen. ^{[ 29 ]} Verschiedene kommerzielle Produkte sind für diesen Zweck erhältlich. ^{[ 30 ]}

Trypanosomen im Gibe- Flusstal im Südwesten Äthiopiens zeigten zwischen Juli 1989 und Februar 1993 eine universelle Resistenz. ^{[ 31 ]} Dies deutet wahrscheinlich auf einen dauerhaften Funktionsverlust in diesem Gebiet gegenüber dem getesteten Zielorganismus, T. congolense, der aus Boran-Rindern isoliert wurde, hin . ^{[ 31 ]}

• Phenanthridin
• Agarose-Gelelektrophorese und Gelelektrophorese von Nukleinsäuren
• GelRed (selbst aus EthBr gewonnen) und GelGreen werden als sicherere und intensivere DNA-Farbstoffe vermarktet.
• Propidiumiodid und Propidiummonoazid , verwandte Farbstoffe

• Medien zum Thema Ethidiumbromid auf Wikimedia Commons