Kraftspektroskopie

Die Kraftspektroskopie umfasst verschiedene Techniken zur Untersuchung der Wechselwirkungen und Bindungskräfte zwischen einzelnen Molekülen. ^{[ 1 ] [ 2 ]} Mit diesen Methoden lassen sich die mechanischen Eigenschaften einzelner Polymermoleküle oder Proteine ​​sowie einzelner chemischer Bindungen messen . Die Bezeichnung „Kraftspektroskopie “ ist, obwohl in der wissenschaftlichen Gemeinschaft weit verbreitet, etwas irreführend, da keine echte Materie-Strahlungs-Wechselwirkung stattfindet . ^{[ 3 ]}

Zu den Techniken, die zur Durchführung der Kraftspektroskopie eingesetzt werden können, gehören die Rasterkraftmikroskopie ^{[ 2 ]} , optische Pinzetten ^{[ 4 ]} , magnetische Pinzetten , akustische Kraftspektroskopie ^{[ 5 ]} , Mikronadeln ^{[ 6 ]} und Biomembranen ^{[ 7 ] .}

Die Kraftspektroskopie misst das Verhalten eines Moleküls unter Dehnungs- oder Torsionskräften . Auf diese Weise wurden in den letzten Jahren viele Erkenntnisse über die mechanochemische Kopplung der Enzyme gewonnen, die für die Muskelkontraktion , den Transport in der Zelle , die Energiegewinnung (F1-ATPase), die DNA -Replikation und -Transkription (Polymerasen) sowie die DNA-Entknotung und -Entwindung (Topoisomerasen und Helikasen) verantwortlich sind. ^{[ 8 ]}

Als Einzelmolekültechnik , im Gegensatz zu typischen Ensemble- Spektroskopien, ermöglicht sie es Forschern, die Eigenschaften des jeweiligen untersuchten Moleküls zu bestimmen. Insbesondere können seltene Ereignisse wie Konformationsänderungen beobachtet werden, die in einem Ensemble nicht sichtbar sind.

Es gibt viele Möglichkeiten, einzelne Moleküle präzise zu manipulieren. Zu den wichtigsten gehören optische oder magnetische Pinzetten, Cantilever für Rasterkraftmikroskope (AFM) und die akustische Kraftspektroskopie. Bei all diesen Techniken wird ein Biomolekül, beispielsweise ein Protein, eine DNA oder ein anderes Biopolymer, mit einem Ende an eine Oberfläche oder ein mikrometergroßes Kügelchen und mit dem anderen an einen Kraftsensor gebunden. Der Kraftsensor ist üblicherweise ein mikrometergroßes Kügelchen oder ein Cantilever, dessen Auslenkung zur Bestimmung der Kraft gemessen werden kann.

Auf einer Oberfläche adsorbierte Moleküle werden von einer mikroskopischen Spitze (Nanometer breit) aufgenommen, die sich am Ende eines elastischen Cantilevers befindet. In einer weiterentwickelten Version dieses Experiments (Chemische Kraftmikroskopie) werden die Spitzen kovalent mit den interessierenden Molekülen funktionalisiert. ^{[ 9 ]} Ein piezoelektrischer Regler zieht den Cantilever anschließend nach oben. Wirkt eine Kraft auf den elastischen Cantilever (beispielsweise durch die Dehnung eines Moleküls zwischen Oberfläche und Spitze), so wird dieser nach oben (abstoßende Kraft) oder nach unten (anziehende Kraft) ausgelenkt. Gemäß dem Hookeschen Gesetz ist diese Auslenkung proportional zur auf den Cantilever wirkenden Kraft. Die Auslenkung wird über die Position eines vom Cantilever reflektierten Laserstrahls gemessen . Mit dieser Anordnung lassen sich Kräfte bis hinunter zu 10 pN (10⁻¹¹ ^N ) messen ; die fundamentale Auflösungsgrenze wird durch das thermische Rauschen des Cantilevers bestimmt .

Die sogenannte Kraftkurve ist der Graph der Kraft (genauer: der Auslenkung des Cantilevers) in Abhängigkeit von der piezoelektrischen Position auf der Z-Achse. Eine ideale Hookesche Feder würde beispielsweise eine gerade, diagonale Kraftkurve aufweisen. Typischerweise bestehen die in Kraftspektroskopie-Experimenten beobachteten Kraftkurven aus einem Kontaktbereich (Diagonalbereich), in dem die Sonde die Probenoberfläche berührt, und einem Nicht-Kontaktbereich, in dem die Sonde keinen Kontakt zur Probenoberfläche hat. Sobald die Rückstellkraft des Cantilevers die Adhäsionskraft zwischen Spitze und Probe übersteigt, springt die Sonde aus dem Kontakt. Die Größe dieses Sprungs wird häufig als Maß für die Adhäsionskraft oder die Bruchkraft verwendet. Im Allgemeinen ist das Aufbrechen einer Verbindung zwischen Spitze und Oberfläche ein stochastischer Prozess; daher erfordert eine zuverlässige Quantifizierung der Adhäsionskraft die Aufnahme mehrerer einzelner Kraftkurven. Das Histogramm der in diesen Mehrfachmessungen erhaltenen Adhäsionskräfte liefert die wichtigsten Daten für die Kraftspektroskopie.

In der Biophysik kann die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie zur Untersuchung der Energielandschaft der Wechselwirkung zwischen zwei Biomolekülen, wie beispielsweise Proteinen, eingesetzt werden. Dabei wird ein Bindungspartner über ein flexibles Linkermolekül (PEG-Kette) an die Spitze eines Cantilevers gebunden, während der andere auf einer Substratoberfläche immobilisiert wird. In einem typischen Verfahren wird der Cantilever wiederholt mit konstanter Geschwindigkeit an die Probe herangeführt und wieder zurückgezogen. In einigen Fällen kommt es zur Bindung zwischen den beiden Partnern, die in der Kraftkurve sichtbar wird, da die Verwendung eines flexiblen Linkers eine charakteristische Kurvenform (siehe Wurmkettenmodell ) erzeugt, die sich von der Adhäsion unterscheidet. Die gemessenen Abreißkräfte können anschließend in Abhängigkeit von der Bindungsbelastungsrate analysiert werden. Das resultierende Diagramm der mittleren Abreißkraft in Abhängigkeit von der Belastungsrate wird als Kraftspektrum bezeichnet und bildet den grundlegenden Datensatz für die dynamische Kraftspektroskopie . ^{[ 10 ] [ 11 ]}

Im Idealfall einer einzigen scharfen Energiebarriere für die Wechselwirkung zwischen Spitze und Probe zeigt das dynamische Kraftspektrum einen linearen Anstieg der Bruchkraft in Abhängigkeit vom Logarithmus der Belastungsrate, wie in einem von Bell et al. ^{[ 12 ]} vorgeschlagenen Modell beschrieben. Hierbei entspricht die Steigung des Bruchkraftspektrums dem Abstand vom Energieminimum zum Übergangszustand . Bislang existieren zahlreiche theoretische Modelle, die den Zusammenhang zwischen Belastungsrate und Bruchkraft beschreiben. Diese basieren auf unterschiedlichen Annahmen und sagen verschiedene Kurvenverläufe voraus. ^{[ 11 ] [ 13 ]}${\displaystyle {\frac {k_{B}T}{x_{\beta }}}}$${\displaystyle x_{\beta }}$

Beispielsweise nutzten Ma X., Gosai A. et al. die dynamische Kraftspektroskopie zusammen mit Molekulardynamiksimulationen, um die Bindungskraft zwischen Thrombin, einem Blutgerinnungsprotein, und seinem DNA-Aptamer zu ermitteln. ^{[ 14 ]}

Eine neu entwickelte Technik, die akustische Kraftspektroskopie (AFS), ermöglicht die parallele Kraftmanipulation hunderter einzelner Moleküle und Zellen und bietet somit einen hohen experimentellen Durchsatz. ^{[ 5 ]} Bei dieser Technik regt ein piezoelektrisches Element planare akustische Wellen über einem mikrofluidischen Chip resonant an. Die erzeugten akustischen Wellen können Kräfte auf Mikrokügelchen mit einer anderen Dichte als das umgebende Medium ausüben. Biomoleküle wie DNA, RNA oder Proteine ​​können einzeln zwischen den Mikrokügelchen und einer Oberfläche fixiert und anschließend mit den vom piezoelektrischen Sensor erzeugten akustischen Kräften untersucht werden. Mit AFS-Geräten lassen sich Kräfte von 0 bis zu mehreren hundert Pikonewton auf hunderte Mikrokügelchen anwenden und Kraft-Dehnungs-Kurven oder Histogramme der Bruchkräfte vieler einzelner Ereignisse parallel erfassen.

Diese Technik wird hauptsächlich zur Untersuchung von DNA-bindenden Proteinen eingesetzt. Beispielsweise wurde AFS verwendet, um die bakterielle Transkription in Gegenwart antibakterieller Substanzen zu untersuchen. ^{[ 15 ]} Auch virale Proteine ​​können mit AFS untersucht werden; so wurde diese Technik beispielsweise zusammen mit anderen Einzelmolekülmethoden zur Erforschung der DNA-Kompaktierung eingesetzt. ^{[ 16 ]}

Zellen können auch direkt durch akustische Kräfte oder mithilfe von Mikrokügelchen als Griffe manipuliert werden. ^{[ 17 ]}

Eine weitere Technik, die in Einzelmolekülexperimenten zunehmend an Bedeutung gewinnt, ist die Verwendung optischer Pinzetten zur Ausübung mechanischer Kräfte auf Moleküle. Ein stark fokussierter Laserstrahl kann Partikel (aus dielektrischem Material) im Größenbereich von Nanometern bis Mikrometern einfangen und festhalten. Die Fangwirkung der optischen Pinzette beruht auf der Dipol- oder optischen Gradientenkraft auf die dielektrische Kugel. Die Technik, einen fokussierten Laserstrahl als Atomfalle zu nutzen, wurde erstmals 1984 in den Bell Laboratories angewendet. Bis dahin wurden Experimente mit entgegengesetzt gerichteten Lasern durchgeführt, um Partikel einzufangen. Spätere Experimente, im Rahmen desselben Projekts in den Bell Laboratories und in anderen Forschungseinrichtungen, zeigten die zerstörungsfreie Manipulation von Zellen mithilfe eines Infrarotlasers. Damit war der Grundstein für biologische Experimente mit optischer Pinzette gelegt.

Jede Technik hat ihre Vor- und Nachteile. Beispielsweise können AFM-Cantilever Ereignisse im Angström-Bereich, Millisekunden-Zeiten und Kräfte von über 10 pN messen. Glasfasern erreichen zwar keine so hohe räumliche und zeitliche Auflösung, können aber Kräfte im Pikonewton-Bereich messen. Optische Pinzetten ermöglichen die Messung von Kräften im Pikonewton-Bereich und Verschiebungen im Nanometer-Bereich – ein idealer Messbereich für viele biologische Experimente. Magnetische Pinzetten können Kräfte im Femtonewton-Bereich messen und zusätzlich auch Torsion anlegen. AFS-Geräte ermöglichen die statistische Analyse der mechanischen Eigenschaften biologischer Systeme, indem sie parallel Kräfte im Pikonewton-Bereich auf Hunderte einzelner Partikel anwenden – mit einer Reaktionszeit im Submillisekundenbereich.

Gängige Anwendungen der Kraftspektroskopie sind Messungen der Polymerelastizität , insbesondere von Biopolymeren wie RNA und DNA . ^{[ 18 ]} Eine weitere biophysikalische Anwendung der Polymerkraftspektroskopie ist die Untersuchung der Proteinentfaltung . ^{[ 19 ]} Modulare Proteine ​​können an eine Gold- oder (seltener) Glimmeroberfläche adsorbiert und anschließend gedehnt werden. Die sequentielle Entfaltung der Module zeigt sich als charakteristisches Sägezahnmuster im Kraft-Dehnungs-Diagramm; jeder Zahn entspricht der Entfaltung eines einzelnen Proteinmoduls (mit Ausnahme des letzten , bei dem sich das Proteinmolekül in der Regel von der Spitze ablöst). Mit dieser Technik lassen sich viele Informationen über die Elastizität und Entfaltung von Proteinen gewinnen. Viele Proteine ​​in der lebenden Zelle sind mechanischer Belastung ausgesetzt.

Darüber hinaus kann die Kraftspektroskopie zur Untersuchung der enzymatischen Aktivität von Proteinen eingesetzt werden, die an der DNA-Replikation , -Transkription , -Organisation und -Reparatur beteiligt sind. Dies geschieht durch Messung der Position eines an einen DNA-Protein-Komplex gebundenen Kügelchens, der an einem DNA-Faden fixiert ist, dessen eines Ende an einer Oberfläche befestigt ist, während die Kraft konstant gehalten wird. Diese Technik wurde beispielsweise zur Untersuchung der Hemmung der Transkriptionselongation durch Klebsidin und Acinetodin verwendet. ^{[ 20 ]}

Die zweite Hauptanwendung der Kraftspektroskopie ist die Untersuchung des mechanischen Widerstands chemischer Bindungen. Hierbei wird die Spitze üblicherweise mit einem Liganden funktionalisiert, der an ein anderes, an der Oberfläche gebundenes Molekül bindet. Die Spitze wird auf die Oberfläche gedrückt, wodurch der Kontakt zwischen den beiden Molekülen ermöglicht wird, und anschließend zurückgezogen, bis die neu gebildete Bindung bricht. Die Kraft, bei der die Bindung bricht, wird gemessen. Da das mechanische Brechen ein kinetischer, stochastischer Prozess ist , ist die Bruchkraft kein absoluter Parameter, sondern eine Funktion von Temperatur und Zuggeschwindigkeit. Niedrige Temperaturen und hohe Zuggeschwindigkeiten korrespondieren mit höheren Bruchkräften. Durch sorgfältige Analyse der Bruchkraft bei verschiedenen Zuggeschwindigkeiten lässt sich die Energielandschaft der chemischen Bindung unter mechanischer Krafteinwirkung abbilden . [ ^{21 ] Dies} führt zu interessanten Ergebnissen bei der Untersuchung von Antikörper - Antigen- , Protein-Protein-, Protein-Zell-Interaktionen und Catch-Bonds . ^{[ 22 ]}

In jüngster Zeit wurde diese Technik in der Zellbiologie eingesetzt , um die aggregativen stochastischen Kräfte zu messen, die von Motorproteinen erzeugt werden und die Bewegung von Partikeln im Zytoplasma beeinflussen. Auf diese Weise kann die Kraftspektrummikroskopie besser genutzt werden, um die vielen zellulären Prozesse zu verstehen, die die Bewegung von Partikeln im Zytoplasma erfordern. ^{[ 23 ]}