Nitrilhydratase

Nitrilhydratasen ( NHasen ; EC 4.2.1.84 ) sind einkernige Eisen- oder nicht-corrinoide Kobaltenzyme , die die Hydratisierung verschiedener Nitrile zu ihren entsprechenden Amiden katalysieren :

RC≡N + H₂O → RC(O)NH₂

Nitrilhydratasen verwenden Fe(III) oder Co(III) an ihren aktiven Zentren. Diese Ionen sind im Low-Spin-Zustand. ^{[ 1 ]}

Die auf Kobalt basierenden Nitrilhydratasen sind seltene Beispiele für Enzyme, die Kobalt verwenden. Kobalt ist, wenn es in Enzymen vorkommt, üblicherweise an einen Corrinring gebunden , wie beispielsweise in Vitamin _B12 .

Der Mechanismus, durch den Kobalt ohne toxische Wirkung zur Nitrilhydratase (NHase) transportiert wird, ist unklar, obwohl eine Kobalt- Permease identifiziert wurde, die Kobalt durch die Zellmembran transportiert. Die Identität des Metalls im aktiven Zentrum einer Nitrilhydratase lässt sich durch Analyse der Sequenzdaten der α-Untereinheit in der Metallbindungsregion vorhersagen. Das Vorhandensein der Aminosäuresequenz VCTLC deutet auf eine kobaltzentrierte NHase hin, während das Vorhandensein von VCSLC auf eine eisenzentrierte NHase hinweist.

Nitrilhydratase und Amidase sind zwei hydratisierende und hydrolytische Enzyme, die für den sequenziellen Stoffwechsel von Nitrilen in Bakterien verantwortlich sind, welche Nitrile als einzige Stickstoff- und Kohlenstoffquelle nutzen können. Zusammen wirken sie als Alternative zur Nitrilaseaktivität , welche die Nitrilhydrolyse ohne Bildung eines primären Amid-Zwischenprodukts durchführt. Eine Sequenz im Genom des Kragengeißeltierchens Monosiga brevicollis kodiert vermutlich für eine Nitrilhydratase. ^{[ 2 ]} Das Gen von M. brevicollis besteht aus den α- und β-Untereinheiten, die zu einem einzigen Gen fusioniert sind. Ähnliche Nitrilhydratase-Gene, die aus einer Fusion der β- und α-Untereinheiten bestehen, wurden seither in mehreren eukaryotischen Supergruppen identifiziert, was darauf hindeutet, dass solche Nitrilhydratasen bereits im letzten gemeinsamen Vorfahren aller Eukaryoten vorhanden waren . ^{[ 3 ]}

Nitrilhydratase (NHasen) wird effizient zur industriellen Acrylamidproduktion aus Acrylnitril [ ^{4 ] mit} einer Jahreskapazität von 600.000 Tonnen ^{[ 5 ]} sowie zur Entfernung von Nitrilen aus Abwasser eingesetzt. Lichtempfindliche NHasen besitzen intrinsisch Stickstoffmonoxid (NO), das an das Eisenzentrum gebunden ist. Dessen Photodissoziation aktiviert das Enzym. Nicotinamid wird industriell ^{[ 4 ]} durch die Hydrolyse von 3-Cyanopyridin, katalysiert durch die Nitrilhydratase aus Rhodococcus rhodochrous J1 ^{[ 6 ] [ 7 ],} hergestellt . Die Jahresproduktion beträgt 3.500 Tonnen Nicotinamid für die Verwendung in Tierfutter. ^{[ 5 ]}

NHasen bestehen aus zwei Arten von Untereinheiten, α und β, die sich in ihrer Aminosäuresequenz unterscheiden. NHasen liegen als αβ-Dimere oder α₂β₂ _- Tetramere _vor und binden jeweils ein Metallatom pro αβ-Einheit. Die 3D-Strukturen zahlreicher NHasen wurden bereits aufgeklärt. Die α-Untereinheit besteht aus einem langen, N-terminalen „Arm“ mit zwei α-Helices und einer C-terminalen Domäne mit einer ungewöhnlichen vierschichtigen Struktur (α-β-β-α). Die β-Untereinheit besteht aus einer langen N-terminalen Schleife, die die α-Untereinheit umschließt, einer helikalen Domäne, die mit der N-terminalen Domäne der α-Untereinheit interagiert, und einer C-terminalen Domäne, die aus einer β-Rolle und einer kurzen Helix besteht.

Ein Assemblierungsmechanismus für die Nitrilhydratase wurde erstmals vorgeschlagen, nachdem Gelfiltrationsversuche gezeigt hatten, dass der Komplex sowohl in der αβ- als auch in der α₂β₂-Form vorliegt. ^{[ 9 ]} In-vitro-Experimente mittels Massenspektrometrie ergaben weiterhin, dass sich die α- und β-Untereinheiten zunächst zum αβ-Dimer zusammenlagern. Die Dimere können dann anschließend miteinander interagieren und ein Tetramer bilden. ^{[ 10 ]}

Das Metallzentrum befindet sich in der zentralen Kavität an der Grenzfläche zwischen zwei Untereinheiten. Alle Proteinliganden des Metallatoms werden von der α-Untereinheit bereitgestellt. Die Proteinliganden des Eisens sind die Seitenketten der drei Cysteinreste (Cys) und zwei Amidstickstoffe der Hauptkette. Das Metallion ist oktaedrisch koordiniert, wobei die Proteinliganden die fünf Ecken eines Oktaeders bilden. Die sechste Position, die für die aktive Spalte zugänglich ist, ist entweder durch NO oder durch einen lösungsmittelaustauschbaren Liganden (Hydroxid oder Wasser) besetzt. Die beiden an das Metall koordinierten Cysteinreste werden posttranslational zu Cys- Sulfinsäure (Cys-SO₂H ₎ und -Sulfensäure (Cys-SOH) modifiziert.

^{Quantenchemische Studien sagten voraus, dass der Cys-SOH-Rest entweder als Base (Aktivierung eines nukleophilen Wassermoleküls) [ 11 ]} oder als Nukleophil ^{[ 12 ]} fungieren könnte . In der Folge wurde die funktionelle Rolle des SOH-Zentrums als Nukleophil experimentell bestätigt. ^{[ 13 ]}