Proteinmethoden sind Techniken zur Untersuchung von Proteinen . Es gibt experimentelle Methoden zur Untersuchung von Proteinen (z. B. zum Nachweis, zur Isolierung und Reinigung von Proteinen sowie zur Charakterisierung ihrer Struktur und Funktion [ 1 ] , wobei häufig eine vorherige Reinigung des Proteins erforderlich ist). Computergestützte Methoden verwenden typischerweise Computerprogramme zur Proteinanalyse. Viele experimentelle Methoden (z. B. Massenspektrometrie ) erfordern jedoch eine computergestützte Analyse der Rohdaten [ 2 ] .

Genetische Methoden

Die experimentelle Analyse von Proteinen erfordert typischerweise deren Expression und Aufreinigung. Die Expression wird durch Manipulation der DNA erreicht, die für das/die gewünschte(n) Protein(e) kodiert. Daher sind für die Proteinanalyse in der Regel DNA-Methoden, insbesondere Klonierung , notwendig . Beispiele für genetische Methoden sind die konzeptuelle Translation, die ortsgerichtete Mutagenese , die Verwendung von Fusionsproteinen und der Abgleich von Allelen mit Krankheitszuständen. [ 3 ] Einige Proteine ​​wurden jedoch noch nie direkt sequenziert, indem Codons bekannter mRNA-Sequenzen mittels konzeptueller Translation in Aminosäuren übersetzt wurden. (Siehe genetischer Code .) Die ortsgerichtete Mutagenese führt gezielt Mutationen ein, die die Struktur eines Proteins verändern. [ 4 ] Die Funktion von Proteinabschnitten lässt sich besser verstehen, indem man die Phänotypveränderung infolge dieser Veränderung untersucht. Fusionsproteine ​​werden durch Einfügen von Protein-Tags, wie z. B. dem His-Tag , hergestellt, um ein modifiziertes Protein zu erzeugen, das leichter verfolgt werden kann. Ein Beispiel hierfür ist GFP-Snf2H, das aus einem Protein besteht, das an ein grün fluoreszierendes Protein gebunden ist und so ein Hybridprotein bildet. Durch die Analyse von DNA- Allelen können diese als mit Krankheitszuständen assoziiert identifiziert werden, beispielsweise bei der Berechnung von LOD-Scores . [ 5 ]

Proteinextraktion aus Geweben

Die Proteinextraktion aus Geweben mit fester extrazellulärer Matrix (z. B. Biopsieproben, Venengewebe, Knorpel, Haut) erfolgt im Labor häufig durch Schlagpulverisierung in flüssigem Stickstoff. [ 6 ] Die Proben werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend einer Schlag- oder mechanischen Zerkleinerung unterzogen. [ 7 ] Da das Wasser in den Proben bei diesen Temperaturen sehr spröde wird, zerfallen die Proben oft in feine Fragmente, die dann zur Proteinextraktion gelöst werden können. Hierfür werden mitunter Edelstahlgeräte, sogenannte Gewebepulverisierer, verwendet. Vorteile dieser Geräte sind die hohe Proteinausbeute aus kleinen, wertvollen Proben; Nachteile sind geringfügige Kreuzkontaminationen. [ 8 ]

Proteinreinigung

Die Proteinreinigung ist ein entscheidender Prozess in der Molekularbiologie und Biochemie, der darauf abzielt, ein spezifisches Protein aus einem komplexen Gemisch, wie z. B. Zelllysaten oder Gewebeextrakten, zu isolieren. [ 9 ] Ziel ist es, das Protein in reiner Form zu gewinnen, das seine biologische Aktivität für weiterführende Untersuchungen, einschließlich funktioneller Assays, Strukturanalysen oder therapeutischer Anwendungen, beibehält. Der Reinigungsprozess umfasst typischerweise mehrere Schritte, darunter Zelllyse, Proteinextraktion und eine Kombination aus chromatographischen und elektrophoretischen Techniken. [ 10 ]

Proteinisolierung

Die Proteinisolierung bezeichnet die Extraktion von Proteinen aus biologischen Proben wie Gewebe, Zellen oder anderen Materialien. Der Prozess beginnt häufig mit der Zelllyse, bei der die Zellmembranen aufgebrochen werden, um die Proteine ​​in Lösung freizusetzen. Dies kann durch physikalische Methoden (z. B. Ultraschallbehandlung, Homogenisierung) oder chemische Methoden (z. B. Detergenzien, Enzyme) erreicht werden. Nach der Lyse wird die Mischung üblicherweise durch Zentrifugation geklärt, um Zelltrümmer und unlösliche Bestandteile zu entfernen. So können die löslichen Proteine ​​für die weitere Aufreinigung gewonnen werden.

Chromatographiemethoden

Die Chromatographie ist eine weit verbreitete Technik zur Proteinreinigung, die die Trennung von Proteinen anhand verschiedener Eigenschaften wie Ladung, Größe und Bindungsaffinität ermöglicht. Im Folgenden werden die wichtigsten Arten der Chromatographie zur Proteinreinigung beschrieben: [ 11 ]

Ionenaustauschchromatographie

Die Ionenaustauschchromatographie trennt Proteine ​​anhand ihrer Nettoladung bei einem bestimmten pH-Wert. [ 12 ] Die stationäre Phase besteht aus geladenen Harzkügelchen, die mit entgegengesetzt geladenen Proteinen interagieren. Während die Probe die Säule passiert, binden die Proteine ​​an das Harz, während ungebundene Proteine ​​abgewaschen werden. Durch schrittweise Änderung der Ionenstärke oder des pH-Werts des Elutionspuffers können gebundene Proteine ​​kontrolliert freigesetzt und somit effektiv getrennt werden.

Größenausschlusschromatographie (Gelfiltration)

Die Größenausschlusschromatographie trennt Proteine ​​anhand ihrer Größe. [ 13 ] Die stationäre Phase besteht aus porösen Kügelchen, die kleinere Moleküle in die Poren lassen, während größere Moleküle an ihnen vorbeifließen. Dadurch eluieren größere Proteine ​​zuerst, gefolgt von kleineren. Diese Methode eignet sich besonders zur Entsalzung oder Entfernung kleiner Verunreinigungen aus Proteinproben.

Affinitätschromatographie

Die Affinitätschromatographie nutzt die spezifischen Wechselwirkungen zwischen Proteinen und ihren Liganden. Ein Zielprotein wird an einer Säule gebunden, die einen spezifisch daran bindenden Liganden enthält, beispielsweise einen Antikörper, ein Enzymsubstrat oder ein Metallion. Nach dem Abwaschen unspezifisch gebundener Proteine ​​wird das Zielprotein mit einer Lösung eluiert, die die Protein-Ligand-Wechselwirkung aufhebt. Diese Methode zeichnet sich durch hohe Spezifität aus und wird häufig zur Aufreinigung rekombinanter Proteine ​​mit Affinitätsmarkierungen eingesetzt.

Proteinextraktion und Solubilisierung

Die Proteinextraktion umfasst die Isolierung von Proteinen aus komplexen biologischen Proben unter Erhalt ihrer Funktionalität. Oftmals ist die sorgfältige Auswahl geeigneter Extraktionspuffer erforderlich, die Salze, Detergenzien oder Stabilisatoren enthalten, um die Proteinstruktur und -aktivität zu bewahren. Der Solubilisierungsschritt ist entscheidend für membrangebundene oder in wässrigen Lösungen unlösliche Proteine. Detergenzien wie Triton X-100 oder SDS können zur Solubilisierung von Membranproteinen eingesetzt werden, indem sie die Lipiddoppelschicht aufbrechen und so eine effektive Extraktion ermöglichen.

Konzentrierte Proteinlösungen

Nach der ersten Reinigung müssen Proteinlösungen unter Umständen konzentriert werden, um die Proteinkonzentration für nachfolgende Anwendungen zu erhöhen. Dies kann durch verschiedene Methoden erreicht werden, darunter Ultrafiltration, bei der semipermeable Membranen Proteine ​​von kleineren Molekülen und Salzen trennen, und Lyophilisation (Gefriertrocknung), bei der Wasser entfernt wird und Proteine ​​stabil gelagert werden können. Auch Fällungsmethoden, wie beispielsweise die Ammoniumsulfatfällung, können zur Proteinkonzentration eingesetzt werden, indem die Löslichkeitsbedingungen verändert werden.

Gelelektrophorese

Die Gelelektrophorese ist eine leistungsstarke Analysetechnik zur Trennung von Proteinen anhand ihrer Größe und Ladung. Die Proteine ​​werden auf eine Gelmatrix, typischerweise aus Polyacrylamid oder Agarose, aufgetragen und ein elektrischer Strom angelegt. Die negativ geladenen Proteine ​​wandern zur positiven Elektrode, wobei kleinere Proteine ​​schneller durch die Gelmatrix wandern als größere. Diese Methode ist entscheidend für die Bestimmung der Reinheit und Größe von Proteinproben.

Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen

Die denaturierende Gelelektrophorese, üblicherweise mittels SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) durchgeführt, beinhaltet die Behandlung von Proteinen mit SDS, einem Detergens, das Proteine ​​denaturiert und ihnen eine gleichmäßige negative Ladung verleiht. Dadurch können Proteine ​​ausschließlich anhand ihres Molekulargewichts getrennt werden, wodurch ein klares Bild der Proteinzusammensetzung einer Probe entsteht.

Gelelektrophorese unter nicht-denaturierenden Bedingungen

Die nicht-denaturierende Gelelektrophorese ermöglicht es, Proteine ​​während der Trennung in ihrer nativen Struktur zu erhalten. Diese Methode eignet sich zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen und Enzymaktivitäten. Die Proteine ​​wandern im Gel entsprechend ihrer Größe und Ladung, ihre funktionellen Eigenschaften bleiben jedoch erhalten, wodurch sich die Methode ideal zur Analyse nativer Proteinkomplexe eignet.

2D-Gelelektrophorese

Die 2D-Gelelektrophorese kombiniert isoelektrische Fokussierung (IEF) und SDS-PAGE zur hochauflösenden Trennung von Proteinen. In der ersten Dimension werden die Proteine ​​anhand ihrer isoelektrischen Punkte (pI) getrennt, in der zweiten Dimension nach ihrer Molekülmasse. Diese Technik ermöglicht die Analyse komplexer Proteingemische und erleichtert die Identifizierung differentiell exprimierter Proteine ​​unter verschiedenen Bedingungen.

Elektrofokussierung

Die Elektrofokussierung ist eine spezielle Technik zur Trennung von Proteinen anhand ihrer isoelektrischen Punkte in einem pH-Gradienten. Durch Anlegen eines elektrischen Feldes wandern die Proteine, bis sie den Punkt erreichen, an dem ihre Nettoladung null ist. Dadurch werden sie in schmale Banden fokussiert. Diese Methode bietet eine hohe Auflösung und wird häufig in Kombination mit anderen Techniken zur umfassenden Proteinanalyse eingesetzt.

Nachweis von Proteinen

In manchen Anwendungen ist es erforderlich, die Gesamtmenge an vorhandenem Protein zu messen, anstatt die Konzentration eines bestimmten Proteins zu bestimmen. In diesen Fällen können unspezifische Proteinbestimmungen zur Quantifizierung der Proteinmenge in einer Probe eingesetzt werden. Gängige unspezifische Proteinbestimmungen sind die Warburg-Christian-Methode , die Kjeldahl-Methode , die Lowry-Methode und die Bradford-Methode . Viele dieser Methoden basieren auf den spektrophotometrischen Eigenschaften von Proteinen selbst oder in Komplexen mit verschiedenen Farbstoffen oder Reagenzien. Die Bradford-Methode beispielsweise nutzt die Absorptionseigenschaften des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue G-250. Im proteinfreien Zustand ist der Farbstoff rot, nach Bindung an Protein färbt er sich blau. [ 14 ] Die Kjeldahl-Methode hingegen verwendet keinen Farbstoff, sondern ist eine titrimetrische Bestimmung, die empfindlich auf den Stickstoffgehalt in der Probe reagiert, welcher mit dem Proteingehalt korreliert. [ 15 ] Diese Methoden unterscheiden sich stark hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit, ihrer Spezifität für Proteine ​​gegenüber anderen Verbindungen in der Probe und ihrer Kosten.

Proteinstrukturen

Wechselwirkungen zwischen Proteinen

Protein-Protein-Interaktionen

Protein-DNA-Wechselwirkungen

Protein-RNA-Interaktionen

Rechenmethoden

Andere Methoden

Siehe auch

Bibliographie

  • Daniel M. Bollag, Michael D. Rozycki und Stuart J. Edelstein. (1996.) Proteinmethoden , 2. Auflage, Wiley Publishers. ISBN 0-471-11837-0Die

Referenzen

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