Übersicht des Zwei-Hybrid-Assays zur Untersuchung von Interaktionen zwischen zwei Proteinen, hier als Köder und Beute bezeichnet . A. Das Gal4- Transkriptionsfaktorgen kodiert für ein Zwei-Domänen-Protein ( BD und AD ), das für die Transkription des Reportergens ( LacZ ) essenziell ist. B , C. Es werden zwei Fusionsproteine ​​hergestellt: Gal4BD+Köder und Gal4AD+Beute . Keines der beiden allein reicht in der Regel aus, um die Transkription (des Reportergens) zu initiieren. D. Sobald beide Fusionsproteine ​​vorliegen und der Köderteil des ersten Fusionsproteins mit dem Beuteteil des zweiten interagiert, erfolgt die Transkription des Reportergens.

Das Zwei-Hybrid-Screening (ursprünglich als Hefe-Zwei-Hybrid-System oder Y2H bekannt ) ist eine molekularbiologische Technik, die zur Entdeckung von Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) [ 1 ] und Protein-DNA-Interaktionen [ 2 ] [ 3 ] verwendet wird , indem physikalische Wechselwirkungen (wie z. B. Bindung) zwischen zwei Proteinen bzw. einem einzelnen Protein und einem DNA- Molekül getestet werden.

Das Prinzip des Tests beruht auf der Aktivierung nachgeschalteter Reportergene durch die Bindung eines Transkriptionsfaktors an eine vorgeschaltete Aktivierungssequenz (UAS). Für das Zwei-Hybrid-Screening wird der Transkriptionsfaktor in zwei separate Fragmente gespalten: die DNA-Bindungsdomäne (DBD oder oft auch BD abgekürzt) und die Aktivierungsdomäne (AD). Die BD bindet an die UAS, die AD aktiviert die Transkription . [ 1 ] [ 2 ] Der Y2H-Test ist somit ein Proteinfragment - Komplementationstest .

Geschichte

Die 1989 von Stanley Fields und Ok-Kyu Song entwickelte Technik diente ursprünglich dem Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen mithilfe des Transkriptionsaktivators Gal4 der Hefe Saccharomyces cerevisiae . Das Gal4- Protein aktivierte die Transkription eines Gens, das am Galaktosestoffwechsel beteiligt ist und die Grundlage für die Selektion bildete. [ 4 ] Seitdem wurde dasselbe Prinzip adaptiert, um zahlreiche alternative Methoden zu beschreiben, darunter solche zum Nachweis von Protein-DNA- oder DNA-DNA-Interaktionen sowie Methoden, die andere Wirtsorganismen wie Escherichia coli oder Säugetierzellen anstelle von Hefe verwenden. [ 3 ] [ 5 ]

Grundvoraussetzung

Der Schlüssel zum Zwei-Hybrid-System liegt darin, dass die aktivierenden und bindenden Domänen der meisten eukaryotischen Transkriptionsfaktoren modular aufgebaut sind und auch ohne direkte Bindung in unmittelbarer Nähe zueinander funktionieren können. [ 6 ] Das bedeutet, dass der Transkriptionsfaktor, selbst wenn er in zwei Fragmente gespalten ist, die Transkription weiterhin aktivieren kann, solange die beiden Fragmente indirekt miteinander verbunden sind.

Die gängigste Screening-Methode ist der Hefe-Zwei-Hybrid-Test. Dabei ist bekannt, wo sich die einzelnen Zielmoleküle auf dem verwendeten Nährmedium (Agarplatten) befinden. Millionen potenzieller Interaktionen in verschiedenen Organismen wurden im letzten Jahrzehnt mithilfe von Hochdurchsatz-Screening- Systemen (oftmals robotergestützt) untersucht, und Tausende von Interaktionen wurden detektiert und in Datenbanken wie BioGRID kategorisiert . [ 7 ] [ 8 ] Dieses System verwendet häufig einen gentechnisch veränderten Hefestamm, dem die Biosynthese bestimmter Nährstoffe (meist Aminosäuren oder Nukleinsäuren ) fehlt. Auf Nährmedien ohne diese Nährstoffe kann die Hefe nicht überleben. Dieser mutierte Hefestamm kann so verändert werden, dass er fremde DNA in Form von Plasmiden integriert . Beim Hefe-Zwei-Hybrid-Screening werden separate Köder- und Zielplasmide gleichzeitig in den mutierten Hefestamm eingebracht oder eine Paarungsstrategie angewendet, um beide Plasmide in eine Wirtszelle zu übertragen. [ 9 ]

Der zweite Hochdurchsatzansatz ist das Bibliotheksscreening. Dabei werden die Köder- und Beutezellen in zufälliger Reihenfolge miteinander verpaart. Nach der Verpaarung und Selektion überlebender Zellen auf Selektionsmedium sequenziert der Wissenschaftler die isolierten Plasmide, um zu ermitteln, welche Beute (DNA-Sequenz) mit dem verwendeten Köder interagiert. Dieser Ansatz weist eine geringere Reproduzierbarkeit auf und führt im Vergleich zum Matrix-Screening tendenziell zu mehr falsch positiven Ergebnissen. [ 9 ]

Plasmide werden so konstruiert, dass sie ein Proteinprodukt erzeugen, bei dem das DNA-Bindungsdomänenfragment (BD) mit einem Protein fusioniert ist. Ein weiteres Plasmid wird so konstruiert, dass es ein Proteinprodukt erzeugt, bei dem das Aktivierungsdomänenfragment (AD) mit einem anderen Protein fusioniert ist. Das mit der BD fusionierte Protein wird als Köderprotein bezeichnet und ist typischerweise ein bekanntes Protein, das zur Identifizierung neuer Bindungspartner verwendet wird. Das mit der AD fusionierte Protein wird als Beuteprotein bezeichnet und kann entweder ein einzelnes bekanntes Protein oder eine Bibliothek bekannter oder unbekannter Proteine ​​sein. Eine solche Bibliothek kann aus einer Sammlung protein-kodierender Sequenzen bestehen, die alle in einem bestimmten Organismus oder Gewebe exprimierten Proteine ​​repräsentieren, oder durch Synthese zufälliger DNA-Sequenzen erzeugt werden. [ 3 ] Unabhängig von ihrer Herkunft werden sie anschließend in die protein-kodierende Sequenz eines Plasmids integriert, das dann in die für das Screening-Verfahren ausgewählten Zellen transfiziert wird. [ 3 ] Bei dieser Technik wird, wenn eine Bibliothek verwendet wird, davon ausgegangen, dass jede Zelle mit höchstens einem einzigen Plasmid transfiziert wird und dass daher jede Zelle letztendlich höchstens ein einziges Mitglied aus der Proteinbibliothek exprimiert.

Interagieren die Köder- und Beuteproteine ​​(binden sie also), werden die AD- und BD-Domänen des Transkriptionsfaktors indirekt miteinander verbunden. Dadurch gelangt die AD-Domäne in die Nähe des Transkriptionsstartpunkts, und die Transkription des/der Reportergene(s) kann erfolgen. Interagieren die beiden Proteine ​​nicht, findet keine Transkription des Reportergens statt. Auf diese Weise ist eine erfolgreiche Interaktion des Fusionsproteins mit einer Veränderung des Zellphänotyps verknüpft. [ 1 ]

Die Herausforderung, Zellen, die Proteine ​​exprimieren, die zufällig mit ihren entsprechenden Fusionsproteinen interagieren, von solchen zu unterscheiden, die dies nicht tun, wird im folgenden Abschnitt behandelt.

Feste Domänen

In jeder Studie werden einige der untersuchten Proteindomänen entsprechend den Studienzielen variiert, während andere, nicht untersuchte Domänen konstant gehalten werden. Beispielsweise wird in einer Zwei-Hybrid-Studie zur Selektion von DNA-Bindungsdomänen die DNA-Bindungsdomäne (BD) variiert, während die beiden interagierenden Proteine ​​(Köder und Beute) konstant bleiben müssen, um eine starke Bindung zwischen BD und AD zu gewährleisten. Für die Auswahl von BD, Köder, Beute und AD stehen zahlreiche Domänen zur Verfügung, sofern diese konstant bleiben sollen. Bei Untersuchungen von Protein-Protein-Interaktionen kann die BD aus einer Vielzahl starker DNA-Bindungsdomänen wie Zif268 ausgewählt werden . [ 2 ] Häufig gewählte Köder- und Beutedomänen sind die Aminosäuren 263–352 des Hefe-Gal11P mit einer N342V-Mutation [ 2 ] bzw. die Aminosäuren 58–97 des Hefe-Gal4 [ 2 ] . Diese Domänen können sowohl in Hefe- als auch in Bakterien-basierten Selektionstechniken verwendet werden und sind dafür bekannt, stark miteinander zu binden. [ 1 ] [ 2 ]

Die gewählte AD muss in der Lage sein, die Transkription des Reportergens mithilfe der zellulären Transkriptionsmaschinerie zu aktivieren. Daher ist die Vielfalt der für Hefe-basierte Techniken verfügbaren ADs möglicherweise nicht für ihre bakteriellen Analoga geeignet. Die aus dem Herpes-simplex-Virus stammende AD VP16 und die Hefe-Gal4-AD wurden erfolgreich in Hefe eingesetzt [ 1 ] , während ein Teil der α-Untereinheit der E. coli -RNA-Polymerase in E. coli -basierten Methoden verwendet wurde [ 2 ] [ 3 ] .

Während stark aktivierende Domänen eine höhere Sensibilität gegenüber schwächeren Interaktionen ermöglichen können, kann umgekehrt eine schwächere AD eine größere Strenge bewirken.

Konstruktion von Expressionsplasmiden

Für die Durchführung einer Zwei-Hybrid-Analyse oder einer ihrer abgeleiteten Techniken müssen mehrere gentechnisch veränderte Gensequenzen in die Wirtszelle eingebracht werden. Die Überlegungen und Methoden zur Konstruktion und zum Einbringen dieser Sequenzen variieren je nach den Anforderungen des jeweiligen Assays und dem als experimenteller Hintergrund gewählten Organismus.

Es gibt zwei Hauptkategorien von Hybridbibliotheken: Zufallsbibliotheken und cDNA-basierte Bibliotheken. Eine cDNA-Bibliothek besteht aus cDNA, die durch reverse Transkription von mRNA aus spezifischen Zelltypen gewonnen wird. Diese Bibliothek kann in ein Konstrukt ligiert werden, sodass sie an die im Assay verwendete BD oder AD angehängt wird. [ 1 ] Eine Zufallsbibliothek verwendet DNA-Abschnitte mit zufälliger Sequenz anstelle dieser cDNA-Abschnitte. Für die Herstellung dieser zufälligen Sequenzen existieren verschiedene Methoden, darunter die Kassettenmutagenese . [ 2 ] Unabhängig von der Herkunft der DNA-Bibliothek wird sie mithilfe geeigneter Restriktionsendonukleasen an der entsprechenden Stelle in das jeweilige Plasmid/Phagenmid ligiert . [ 2 ]

E. coli -spezifische Überlegungen

Durch die Platzierung der Hybridproteine ​​unter der Kontrolle von IPTG -induzierbaren lac- Promotoren werden sie nur auf IPTG-haltigen Medien exprimiert. Darüber hinaus lässt sich durch die Integration verschiedener Antibiotikaresistenzgene in jedes genetische Konstrukt das Wachstum nicht-transformierter Zellen durch Kultivierung auf Medien mit den entsprechenden Antibiotika leicht verhindern. Dies ist besonders wichtig für Gegenselektionsmethoden, bei denen ein Mangel an Interaktion für das Überleben der Zellen erforderlich ist. [ 2 ]

Das Reportergen kann in das E. coli -Genom eingefügt werden, indem es zunächst in ein Episom , eine Art Plasmid mit der Fähigkeit, sich selbst in das bakterielle Zellgenom zu integrieren [ 2 ] , mit einer Kopienzahl von etwa eins pro Zelle eingefügt wird. [ 10 ]

Die Hybridexpressions-Phagemide können in E. coli XL-1 Blue-Zellen elektroporiert werden, was nach Amplifikation und Infektion mit dem Helferphagen VCS-M13 einen Vorrat an Bibliotheksphagen ergibt. Jeder dieser Phagen enthält ein einzelsträngiges Mitglied der Phagemidbibliothek. [ 2 ]

Wiederherstellung von Proteininformationen

Nach erfolgter Selektion muss die Primärstruktur der Proteine ​​mit den entsprechenden Eigenschaften bestimmt werden. Dies geschieht durch die Gewinnung der protein-kodierenden Sequenzen (in ihrer ursprünglichen Form) aus den Zellen mit dem entsprechenden Phänotyp.

E. coli

Das zur Transformation von E. coli- Zellen verwendete Phagemid kann durch Infektion der selektierten Zellen mit dem Helferphagen VCS-M13 gewonnen werden. Die entstehenden Phagenpartikel enthalten die einzelsträngigen Phagemide und werden zur Infektion von XL-1 Blue-Zellen verwendet. [ 2 ] Anschließend werden die doppelsträngigen Phagemide aus diesen XL-1 Blue-Zellen isoliert, wodurch der Prozess zur Herstellung der ursprünglichen Phagenbibliothek im Wesentlichen umgekehrt wird. Abschließend werden die DNA-Sequenzen mittels Didesoxy-Sequenzierung bestimmt . [ 2 ]

Steuerung der Empfindlichkeit

Der aus Escherichia coli stammende Tet-R- Repressor kann zusammen mit einem herkömmlichen Reportergen verwendet und durch Tetracyclin oder Doxycyclin (Tet-R-Inhibitoren) reguliert werden. Die Expression von Tet-R wird somit durch das Standard-Zwei-Hybrid-System kontrolliert, während Tet-R seinerseits die Expression eines zuvor erwähnten Reporters wie HIS3 über seinen Tet-R-Promotor reguliert (reprimiert). Tetracyclin oder seine Derivate können daher zur Regulierung der Sensitivität eines Tet-R-basierten Systems eingesetzt werden. [ 1 ]

Die Sensitivität kann auch durch Variation der Abhängigkeit der Zellen von ihren Reportergenen gesteuert werden. Beispielsweise kann dies durch Änderung der Histidinkonzentration im Wachstumsmedium für his3 - abhängige Zellen und der Streptomycinkonzentration für aadA- abhängige Zellen beeinflusst werden. [ 2 ] [ 3 ] Die Selektionsgenabhängigkeit kann auch durch die Anwendung eines Inhibitors des Selektionsgens in geeigneter Konzentration kontrolliert werden. 3-Amino-1,2,4-triazol (3-AT) ist beispielsweise ein kompetitiver Inhibitor des HIS3 - Genprodukts und kann verwendet werden, um die minimale HIS3- Expression zu titrieren, die für das Wachstum auf histidin-defizienten Medien erforderlich ist. [ 2 ]

Die Sensitivität kann auch durch Variation der Anzahl der Operatorsequenzen in der Reporter-DNA moduliert werden.

Nicht-Fusionsproteine

Ein drittes, nicht-fusioniertes Protein kann zusammen mit zwei Fusionsproteinen exprimiert werden. Je nach Untersuchung kann das dritte Protein eines der Fusionsproteine ​​modifizieren oder deren Interaktion vermitteln oder stören. [ 1 ]

Die gleichzeitige Expression des dritten Proteins kann für die Modifizierung oder Aktivierung eines oder beider Fusionsproteine ​​erforderlich sein. Beispielsweise besitzt S. cerevisiae keine endogene Tyrosinkinase . Wenn eine Untersuchung ein Protein betrifft, das eine Tyrosinphosphorylierung benötigt , muss die Kinase in Form eines Tyrosinkinase-Gens bereitgestellt werden. [ 1 ]

Das Nicht-Fusionsprotein kann die Interaktion vermitteln, indem es beide Fusionsproteine ​​gleichzeitig bindet, wie im Fall der Liganden-abhängigen Rezeptordimerisierung. [ 1 ]

Bei einem Protein mit einem Interaktionspartner kann die funktionelle Homologie zu anderen Proteinen untersucht werden, indem das dritte Protein in nicht-fusionierter Form zugeführt wird. Dieses kann dann mit dem Fusionsprotein um dessen Bindungspartner konkurrieren. Die Bindung zwischen dem dritten Protein und dem anderen Fusionsprotein unterbricht die Bildung des Reporterexpressions-Aktivierungskomplexes und reduziert somit die Reporterexpression, was zu der charakteristischen Phänotypänderung führt. [ 1 ]

Split-Ubiquitin-Hefe-Zwei-Hybrid

Eine Einschränkung klassischer Hefe-Zwei-Hybrid-Systeme besteht darin, dass sie auf lösliche Proteine ​​beschränkt sind. Daher ist es unmöglich, damit Protein-Protein-Interaktionen zwischen unlöslichen integralen Membranproteinen zu untersuchen . Das Split-Ubiquitin-System bietet eine Methode, diese Einschränkung zu überwinden. [ 11 ] In diesem System werden zwei zu untersuchende integrale Membranproteine ​​mit zwei verschiedenen Ubiquitin- Einheiten fusioniert: einer C-terminalen Ubiquitin-Einheit („Cub“, Aminosäuren 35–76) und einer N-terminalen Ubiquitin-Einheit („Nub“, Aminosäuren 1–34). Diese Fusionsproteine ​​werden als Köder bzw. Beute bezeichnet. Die Cub-Einheit ist zusätzlich zur Fusion mit einem integralen Membranprotein auch mit einem Transkriptionsfaktor (TF) fusioniert, der durch Ubiquitin-spezifische Proteasen abgespalten werden kann . Bei der Köder-Beute-Interaktion lagern sich die Nub- und Cub-Einheiten zusammen und bilden das Split-Ubiquitin-System. Das rekonstituierte Split-Ubiquitin-Molekül wird von Ubiquitin-spezifischen Proteasen erkannt, welche den Transkriptionsfaktor abspalten, wodurch dieser die Transkription von Reportergenen induzieren kann . [ 12 ]

Fluoreszenz-Zwei-Hybrid-Assay

Zolghadr und Mitarbeiter stellten ein fluoreszierendes Zwei-Hybrid-System vor, das zwei Hybridproteine ​​nutzt, die mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen sowie dem Lac-Repressor LacI fusioniert sind . Die Struktur der Fusionsproteine ​​sieht folgendermaßen aus: FP2-LacI-Köder und FP1-Beute. Köder- und Beuteprotein interagieren miteinander und bringen die fluoreszierenden Proteine ​​(FP1 = GFP , FP2 = mCherry ) in unmittelbare Nähe zur Bindungsstelle des LacI-Proteins im Genom der Wirtszelle. [ 13 ] Das System kann auch zum Screening von Inhibitoren von Protein-Protein-Interaktionen verwendet werden. [ 14 ]

Enzymatische Zwei-Hybrid-Systeme: KISS

Während das ursprüngliche Y2H-System einen rekonstituierten Transkriptionsfaktor nutzte, erzeugen andere Systeme enzymatische Aktivitäten, um Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) nachzuweisen. Beispielsweise wurde der Kinase-Substrat-Sensor („KISS“), ein Säugetier-Zwei-Hybrid-System, zur Kartierung intrazellulärer PPIs entwickelt. Hierbei wird ein Köderprotein mit einem Kinase -haltigen Abschnitt von TYK2 fusioniert und ein Beuteprotein an ein gp130- Zytokinrezeptorfragment gekoppelt . Bei der Interaktion von Köder und Beuteprotein phosphoryliert TYK2 STAT3 -Bindungsstellen auf der Beute-Chimäre, was letztendlich zur Aktivierung eines Reportergens führt . [ 15 ]

Zwei-Hybrid-Screening durch Sequenzierung

Es wurden verschiedene Strategien entwickelt, bei denen die Zwei-Hybrid-positiven Proteine ​​mittels DNA-Sequenzierung identifiziert werden , üblicherweise nach Selektion mithilfe eines Reportergens . Eine Variante dieses Ansatzes wurde kürzlich als Liquid Y2H-Seq beschrieben . [ 16 ] Nachdem Stanley Fields und Kollegen gezeigt hatten, dass Transkriptionsaktivierungsassays zur Detektion von Protein-Protein-Interaktionen und zum Screening von Bibliotheken nach neuen Bindungspartnern eingesetzt werden können, etablierte sich die praktische Anwendbarkeit der Methode rasch. 1993 führten Vojtek et al. das erste erfolgreiche Zwei-Hybrid-Screening durch, um eine neue Interaktion zu identifizieren. Sie entdeckten, dass die Ras-GTPase physikalisch an die RAF-Kinase bindet – ein Protein, von dem bereits bekannt war, dass es genetisch stromabwärts von Ras wirkt. [ 17 ] Ein weiterer Meilenstein wurde an der Johns Hopkins University erreicht , wo Anton Yuryev zwei neue Proteinfamilien identifizierte, die mit der C-terminalen Domäne (CTD) der RNA-Polymerase II interagieren. Diese Proteinfamilien zeichneten sich durch hochgradig homologe CTD-Interaktionsdomänen (CIDs) aus, was strukturelle Hinweise auf die funktionelle Bedeutung der Interaktionen lieferte. Da diese Proteine ​​auch Homologie zu bekannten Spleißfaktoren aufwiesen, legte diese Entdeckung nahe, dass die CTD die Gentranskription und mRNA-Prozessierung in Eukaryoten physikalisch verknüpft. Yuryev erweiterte die Methodik später, indem er eine Technik zur Identifizierung funktioneller Interaktionen durch die Auswahl isoformspezifischer Bindungspartner vorschlug, die er anhand der drei Isoformen der RAF-Kinase demonstrierte. [ 18 ]

Ein-, Drei- und Ein-Zwei-Hybridvarianten

Ein-Hybrid

Die Ein-Hybrid-Variante dieser Technik dient der Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen und verwendet ein einzelnes Fusionsprotein, bei dem die AD direkt mit der Bindungsdomäne verknüpft ist. Die Bindungsdomäne kann aus einer Bibliothek bestehen und somit anhand von Proteinen ausgewählt werden, die an eine gewünschte Zielsequenz binden (welche in die Promotorregion eines Reportergens eingefügt ist). In einem Positivselektionssystem wird so eine Bindungsdomäne ausgewählt, die erfolgreich an die UAS bindet und die Transkription ermöglicht. [ 1 ]

Es ist zu beachten, dass die Selektion von DNA-Bindungsdomänen nicht notwendigerweise mittels eines Ein-Hybrid-Systems erfolgt, sondern auch mithilfe eines Zwei-Hybrid-Systems, bei dem die Bindungsdomäne variiert und die Köder- und Beuteproteine ​​konstant gehalten werden. [ 2 ] [ 3 ]

Ein-Hybrid-Screenings können zur Untersuchung der transkriptionellen Aktivierungseigenschaften von Proteinen eingesetzt werden. Dies wurde in einem großen Screening von Hefeproteinen durchgeführt, die mit einer DNA-Bindungsdomäne fusioniert wurden . Das Fusionsprotein aktivierte die Transkription eines Reportergens . Dabei wurden 451 transkriptionelle Aktivatoren in Hefe identifiziert, darunter 132 starke Aktivatoren. [ 19 ]

Drei-Hybrid

Überblick über den Drei-Hybrid-Test.

RNA-Protein-Interaktionen wurden mittels einer Drei-Hybrid-Variante der Zwei-Hybrid-Technik untersucht. Hierbei dient ein hybrides RNA-Molekül dazu, die beiden Proteinfusionsdomänen miteinander zu verbinden. Diese sollen nicht miteinander, sondern über ihre RNA-Bindungsdomänen mit dem intermediären RNA-Molekül interagieren. [ 1 ] Techniken mit Nicht-Fusionsproteinen, die eine ähnliche Funktion erfüllen (siehe Abschnitt „Nicht-Fusionsproteine“ weiter oben), können ebenfalls als Drei-Hybrid-Methoden bezeichnet werden.

Ein-Zwei-Hybrid

Die gleichzeitige Anwendung der Ein- und Zwei-Hybrid-Methode (d. h. die gleichzeitige Untersuchung von Protein-Protein- und Protein-DNA-Interaktionen) wird als Ein-Zwei-Hybrid-Ansatz bezeichnet und soll die Aussagekraft des Screenings erhöhen. [ 1 ]

Wirtsorganismus

Theoretisch könnte jede lebende Zelle als Hintergrund für eine Zwei-Hybrid-Analyse verwendet werden, doch praktische Erwägungen bestimmen die Wahl der Zelllinie. Diese sollte relativ kostengünstig und einfach zu kultivieren sowie robust genug sein, um den angewandten Untersuchungsmethoden und Reagenzien standzuhalten. [ 1 ] Letzteres ist besonders wichtig für Hochdurchsatzstudien . Daher ist die Hefe *Saccharomyces cerevisiae* der wichtigste Wirtsorganismus für Zwei-Hybrid-Studien. Sie ist jedoch nicht immer das ideale System zur Untersuchung interagierender Proteine ​​anderer Organismen. [ 20 ] Hefezellen weisen oft nicht dieselben posttranslationalen Modifikationen auf, haben eine andere Codonverwendung oder es fehlen ihnen bestimmte Proteine, die für die korrekte Expression der Proteine ​​wichtig sind. Um diese Probleme zu lösen, wurden verschiedene neue Zwei-Hybrid-Systeme entwickelt. Je nach System werden Agarplatten oder spezifische Wachstumsmedien verwendet, um die Zellen zu kultivieren und Interaktionen zu selektieren. Die gebräuchlichste Methode ist die Agarplattenmethode, bei der Zellen auf selektivem Medium ausplattiert werden, um Interaktionen zu beobachten. Zellen ohne Interaktionsproteine ​​sollten auf diesem Selektivmedium nicht überleben können. [ 7 ] [ 21 ]

S. cerevisiae (Hefe)

Die Hefe *Saccharomyces cerevisiae* diente als Modellorganismus bei der Entwicklung der Zwei-Hybrid-Technik. Sie ist allgemein als Y2H-System bekannt. Mehrere Eigenschaften machen sie zu einem robusten Wirt für diese Interaktion, darunter die Fähigkeit zur Bildung tertiärer Proteinstrukturen, ein neutraler pH-Wert im Zellinneren, eine erhöhte Fähigkeit zur Bildung von Disulfidbrücken und reduziertes Glutathion sowie weitere cytosolische Pufferfaktoren, die ein günstiges internes Milieu gewährleisten. [ 1 ] Das Hefemodell lässt sich mit nicht-molekularen Methoden manipulieren, und seine vollständige Genomsequenz ist bekannt. [ 1 ] Hefesysteme sind tolerant gegenüber verschiedenen Kulturbedingungen und aggressiven Chemikalien, die in Säugetierzellkulturen nicht anwendbar sind. [ 1 ]

Für Y2H-Screenings wurden verschiedene Hefestämme entwickelt, z. B. Y187 [ 22 ] und AH109 [ 23 ] , beide hergestellt von Clontech . Auch die Hefestämme R2HMet und BK100 wurden verwendet. [ 24 ]

Candida albicans

Candida albicans ist eine Hefe mit einer Besonderheit: Sie übersetzt das CUG-Codon in Serin anstatt in Leucin. Aufgrund dieser abweichenden Codonverwendung ist es schwierig, das Modellsystem Saccharomyces cerevisiae als Hefe-Zwei-Hybrid-System (Y2H) zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen mit C. albicans -Genen zu verwenden. Um eine natürlichere Umgebung zu schaffen, wurde ein C. albicans -Zwei-Hybrid-System (C2H) entwickelt. Mit diesem System können Protein-Protein-Interaktionen direkt in C. albicans untersucht werden . [ 25 ] [ 26 ] Kürzlich wurde zudem ein Hochdurchsatzsystem entwickelt. [ 27 ] [ 28 ] [ 29 ]

E. coli

Bakterielle Zwei-Hybrid-Methoden (B2H oder BTH) werden üblicherweise in E. coli durchgeführt und bieten einige Vorteile gegenüber Hefe-basierten Systemen. Beispielsweise ermöglicht die höhere Transformationseffizienz und das schnellere Wachstum von E. coli die Verwendung größerer Bibliotheken (über 10⁸ ) . [ 2 ] Das Fehlen eines Kernlokalisierungssignals in der Proteinsequenz und die Möglichkeit, Proteine ​​zu untersuchen, die für Hefe toxisch wären, sind ebenfalls wichtige Faktoren bei der Wahl des experimentellen Hintergrundorganismus. [ 2 ]

Die Methylierungsaktivität bestimmter DNA-Methyltransferasen von E. coli kann die Selektion einiger DNA-bindender Proteine ​​beeinträchtigen. Ist dies zu erwarten, bietet sich die Verwendung eines E. coli -Stammes mit einem Defekt in der jeweiligen Methyltransferase an. [ 2 ] Das B2H-System ist möglicherweise nicht optimal für die Untersuchung eukaryotischer Protein-Protein-Interaktionen (z. B. menschlicher Proteine), da Proteine ​​sich unter Umständen nicht wie in eukaryotischen Zellen falten oder andere Prozessierungsschritte fehlen können.

Säugetierzellen

In den letzten Jahren wurde ein Säugetier-Zwei-Hybrid-System (M2H) entwickelt, um Protein-Protein-Interaktionen in Säugetieren in einer zellulären Umgebung zu untersuchen, die die natürliche Proteinumgebung möglichst genau nachbildet. [ 30 ] In diesem System werden transient transfizierte Säugetierzellen verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zu identifizieren. [ 31 ] [ 32 ] Die Verwendung einer Säugetierzelllinie zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen bietet den Vorteil, in einem natürlicheren Kontext zu arbeiten. [ 5 ] Die posttranslationalen Modifikationen, Phosphorylierung, Acylierung und Glykosylierung sind vergleichbar. Auch die intrazelluläre Lokalisation der Proteine ​​wird im Vergleich zu einem Hefe-Zwei-Hybrid-System genauer wiedergegeben. [ 33 ] [ 34 ] Mit dem Säugetier-Zwei-Hybrid-System lassen sich zudem Signal-Inputs untersuchen. [ 35 ] Ein weiterer großer Vorteil ist, dass Ergebnisse innerhalb von 48 Stunden nach der Transfektion vorliegen. [ 5 ]

Arabidopsis thaliana

Im Jahr 2005 wurde ein Zwei-Hybrid-System in Pflanzen entwickelt. Mithilfe von Protoplasten aus Arabidopsis thaliana lassen sich Protein-Protein-Interaktionen in Pflanzen untersuchen. Dadurch können die Interaktionen in ihrem natürlichen Kontext analysiert werden. In diesem System stehen die GAL4-AD- und -BD-Domänen unter der Kontrolle des starken 35S-Promotors. Die Interaktion wird mithilfe eines GUS-Reporters gemessen. Um ein Hochdurchsatz-Screening zu ermöglichen, wurden die Vektoren Gateway-kompatibel gemacht . Das System ist als Protoplasten-Zwei-Hybrid-System (P2H) bekannt. [ 36 ]

Aplysia californica

Der Seehase *Angiosoma californica* dient in der Neurobiologie als Modellorganismus, unter anderem zur Untersuchung der molekularen Mechanismen des Langzeitgedächtnisses. Um neurologisch wichtige Interaktionen in einer naturnäheren Umgebung zu erforschen, wurde in Neuronen von *A. californica* ein Zwei-Hybrid-System entwickelt . In diesem System werden die Gene *GAL4 AD* und *BD* verwendet. [ 37 ] [ 38 ]

Bombyx mori

In einer Seidenraupenzelllinie, die aus der Larve bzw. Raupe des domestizierten Seidenspinners Bombyx mori (BmN4-Zellen) stammt, wurde ein Insekten-Zwei-Hybrid-System (I2H) entwickelt. Dieses System nutzt die GAL4-Bindungsdomäne und die Aktivierungsdomäne des Maus-NF-κB P65. Beide stehen unter der Kontrolle des OpIE2-Promotors. [ 39 ]

Anwendungen

Bestimmung von Sequenzen, die für die Interaktion entscheidend sind

Durch die Veränderung spezifischer Aminosäuren mittels Mutation der entsprechenden DNA-Basenpaare in den verwendeten Plasmiden kann die Bedeutung dieser Aminosäurereste für die Aufrechterhaltung der Interaktion bestimmt werden. [ 1 ]

Nach der Selektion von DNA-bindenden Proteinen mithilfe bakterieller Zellmethoden muss die Spezifität dieser Domänen überprüft werden, da das bakterielle Zellgenom nur begrenzt als Speicher für Domänen mit Affinität zu anderen Sequenzen (oder generell zu DNA) fungieren kann. [ 2 ]

Drogen- und Giftentdeckung

Protein-Protein-Signalinteraktionen stellen aufgrund ihrer Spezifität und weiten Verbreitung geeignete therapeutische Ziele dar. Der Ansatz der zufälligen Wirkstoffentwicklung nutzt Substanzbibliotheken mit zufälligen chemischen Strukturen und erfordert ein Hochdurchsatzverfahren, um diese Strukturen an ihrem Zielort zu testen. [ 1 ] [ 21 ]

Die für die Untersuchung ausgewählte Zelle kann gezielt so konstruiert werden, dass sie den molekularen Aspekt widerspiegelt, den der Forscher untersuchen möchte, und anschließend zur Identifizierung neuer Therapeutika oder Schädlingsbekämpfungsmittel für Mensch oder Tier verwendet werden. [ 1 ] [ 21 ]

Bestimmung der Proteinfunktion

Durch die Bestimmung der Interaktionspartner unbekannter Proteine ​​lassen sich Rückschlüsse auf die möglichen Funktionen dieser neuen Proteine ​​ziehen. [ 1 ] Dies kann durch Vergleich eines einzelnen bekannten Proteins mit einer Bibliothek unbekannter Proteine ​​oder umgekehrt durch Selektion aus einer Bibliothek bekannter Proteine ​​mithilfe eines einzelnen Proteins unbekannter Funktion erfolgen. [ 1 ]

Zinkfingerprotein-Auswahl

Zur Auswahl von Zinkfingerproteinen (ZFPs) für das Protein-Engineering wurden erfolgreich Methoden eingesetzt, die von der Zwei-Hybrid-Screening-Technik adaptiert wurden. [ 2 ] [ 3 ] Ein ZFP ist selbst ein DNA-bindendes Protein, das beim Aufbau maßgeschneiderter DNA-Bindungsdomänen verwendet wird, die an eine gewünschte DNA-Sequenz binden. [ 40 ]

Durch die Verwendung eines Selektionsgens mit der gewünschten Zielsequenz innerhalb der UAS und die Randomisierung der relevanten Aminosäuresequenzen zur Erzeugung einer ZFP-Bibliothek können Zellen selektiert werden, die eine DNA-ZFP-Interaktion mit den erforderlichen Eigenschaften aufweisen. Da jedes ZFP typischerweise nur 3–4 Basenpaare erkennt, wird das randomisierte ZFP in ein „Gerüst“ aus zwei weiteren ZFPs mit konstanter Sequenz eingebaut, um die Erkennung von Stellen außerhalb der UAS zu verhindern. Die UAS ist somit so konzipiert, dass sie neben der Sequenz, für die ein ZFP selektiert wird, auch die Zielsequenz des konstanten Gerüsts enthält. [ 2 ] [ 3 ]

Mit diesem System können auch eine Reihe anderer DNA-Bindungsdomänen untersucht werden. [ 2 ]

Stärken

  • Zwei-Hybrid-Screenings sind Low-Tech-Verfahren; sie können in jedem Labor ohne aufwendige Ausrüstung durchgeführt werden.
  • Zwei-Hybrid-Screenings können einen wichtigen ersten Hinweis zur Identifizierung von Interaktionspartnern liefern.
  • Das Verfahren ist skalierbar und ermöglicht so das Screening von Interaktionen zwischen vielen Proteinen. Darüber hinaus lässt es sich automatisieren, und mithilfe von Robotern können in relativ kurzer Zeit zahlreiche Proteine ​​gegen Tausende potenziell interagierender Proteine ​​gescreent werden. Zwei Arten von groß angelegten Screenings kommen zum Einsatz: der Bibliotheksansatz und der Matrixansatz.
  • Die mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-System gewonnenen Daten können eine ähnliche Qualität aufweisen wie die Daten, die mit dem alternativen Verfahren der Koaffinitätsreinigung mit anschließender Massenspektrometrie (AP/MS) erzeugt wurden. [ 41 ] [ 9 ]

Schwächen

  • Der Hauptkritikpunkt am Hefe-Zwei-Hybrid-Screening von Protein-Protein-Interaktionen ist die Möglichkeit einer hohen Anzahl falsch positiver (und falsch negativer) Ergebnisse. Die genaue Rate falsch positiver Ergebnisse ist nicht bekannt, frühere Schätzungen lagen jedoch bei bis zu 70 %. Dies erklärt teilweise auch die häufig beobachtete geringe Übereinstimmung der Ergebnisse bei einem (Hochdurchsatz-)Zwei-Hybrid-Screening, insbesondere bei Verwendung unterschiedlicher experimenteller Systeme. [ 9 ] [ 32 ]

Die Ursache für diese hohe Fehlerrate liegt in den Eigenschaften des Bildschirms:

  • Bestimmte Testvarianten überexprimieren die Fusionsproteine, was zu unnatürlichen Proteinkonzentrationen und damit zu unspezifischen (falsch) positiven Ergebnissen führen kann.
  • Bei den Hybridproteinen handelt es sich um Fusionsproteine; das heißt, die fusionierten Teile können bestimmte Wechselwirkungen hemmen, insbesondere wenn eine Wechselwirkung am N-Terminus eines Testproteins stattfindet (wo typischerweise die DNA-Bindungs- oder Aktivierungsdomäne angebracht ist).
  • Eine Interaktion findet möglicherweise nicht in Hefe statt, dem typischen Wirtsorganismus für Y2H. Wird beispielsweise ein bakterielles Protein in Hefe getestet, fehlt ihm möglicherweise ein Chaperon für die korrekte Faltung, das nur in seinem bakteriellen Wirt vorhanden ist. Darüber hinaus wird ein Säugetierprotein in Hefe manchmal nicht korrekt modifiziert (z. B. fehlt die Phosphorylierung ), was ebenfalls zu falschen Ergebnissen führen kann.
  • Die Y2H-Reaktion findet im Zellkern statt. Wenn Testproteine ​​nicht im Zellkern lokalisiert sind (weil sie andere Lokalisierungssignale besitzen), kann es vorkommen, dass zwei interagierende Proteine ​​nicht miteinander interagieren.
  • Manche Proteine ​​interagieren möglicherweise spezifisch, wenn sie in der Hefe gemeinsam exprimiert werden, obwohl sie in Wirklichkeit nie gleichzeitig in derselben Zelle vorhanden sind. In den meisten Fällen kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass solche Proteine ​​in bestimmten Zellen oder unter bestimmten Umständen exprimiert werden.

Jeder dieser Punkte allein kann zu falschen Ergebnissen führen. Aufgrund der kombinierten Auswirkungen aller Fehlerquellen müssen Hefe-Zwei-Hybrid-Daten mit Vorsicht interpretiert werden. Die Wahrscheinlichkeit falsch positiver Ergebnisse erfordert die Bestätigung aller Interaktionen durch einen zuverlässigen Test, beispielsweise durch Co-Immunpräzipitation der endogenen Proteine. Dies ist jedoch bei umfangreichen Protein-Protein-Interaktionsdaten schwierig. Alternativ können Y2H-Daten mithilfe mehrerer Y2H-Varianten [ 42 ] oder bioinformatischer Verfahren verifiziert werden. Letztere prüfen, ob interagierende Proteine ​​gleichzeitig exprimiert werden, gemeinsame Merkmale aufweisen (wie z. B. Genontologie- Annotationen oder bestimmte Netzwerkstrukturen ) oder homologe Interaktionen in anderen Spezies zeigen [ 43 ] .

Siehe auch

  • Phagen-Display , eine alternative Methode zum Nachweis von Protein-Protein- und Protein-DNA-Interaktionen
  • Protein-Array , eine Chip-basierte Methode zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen
  • Synthetische Genarray- Analyse, eine auf Hefe basierende Methode zur Untersuchung von Geninteraktionen

Referenzen

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