Die synthetische genetische Array-Analyse ( SGA ) ist eine Hochdurchsatzmethode zur Untersuchung synthetisch letaler und synthetisch kranker genetischer Interaktionen ( SSL ). [ 1 ] SGA ermöglicht die systematische Konstruktion von Doppelmutanten durch eine Kombination aus rekombinanten genetischen Techniken , Kreuzung und Selektion. Mithilfe der SGA-Methodik kann eine Deletionsmutante eines bestimmten Gens mit einem gesamten Genom-Deletionssatz gekreuzt werden, um SSL- Interaktionen zu identifizieren. Dies liefert funktionelle Informationen über das zu untersuchende Gen und die Gene, mit denen es interagiert. Eine groß angelegte Anwendung von SGA, bei der ca. 130 zu untersuchende Gene mit ca. 5000 lebensfähigen Deletionsmutanten in Hefe gekreuzt wurden, ergab ein genetisches Netzwerk mit ca. 1000 Genen und ca. 4000 SSL-Interaktionen. [ 2 ] Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass Gene mit ähnlicher Funktion tendenziell miteinander interagieren und dass Gene mit ähnlichen Mustern genetischer Interaktionen häufig Produkte kodieren, die im selben Stoffwechselweg oder Komplex wirken. Die synthetische genetische Array-Analyse wurde ursprünglich mit dem Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae entwickelt . Diese Methode wurde inzwischen erweitert und deckt nun 30 % des Genoms von S. cerevisiae ab . [ 3 ] Es wurden seither Methoden entwickelt, die die SGA-Analyse in S. pombe [ 4 ] [ 5 ] und E. coli [ 6 ] [ 7 ] ermöglichen .

Anordnung von Hefezellen, die synthetisch-letale Wechselwirkungen zeigen. Synthetisch-letale Wechselwirkungen sind jene Koloniepaare, bei denen das Wachstum reduziert oder nicht vorhanden ist.

Hintergrund

Die Analyse synthetischer genetischer Arrays (SGA) wurde ursprünglich 2001 von Tong et al. [ 1 ] entwickelt und wird seither von zahlreichen Forschungsgruppen in verschiedensten biomedizinischen Bereichen eingesetzt. SGA nutzt den gesamten Genom-Knockout-Satz der Hefe, der im Rahmen des Hefegenom-Deletionsprojekts erstellt wurde. [ 8 ]

Verfahren

Synthetische Genarray-Analysen werden üblicherweise mit Kolonie-Arrays auf Petrischalen bei Standarddichten (96, 384, 768, 1536) durchgeführt. Für eine SGA-Analyse in S. cerevisiae wird die zu untersuchende Gen-Deletion systematisch mit einem Deletionsmutanten-Array (DMA) gekreuzt, das alle lebensfähigen Knockout- ORFs des Hefegenoms enthält (derzeit 4786 Stämme). [ 9 ] Die resultierenden Diploiden werden durch Überführen auf ein stickstoffreduziertes Medium sporuliert. Die haploiden Nachkommen werden anschließend einer Reihe von Selektionsverfahren unterzogen, um Doppelmutanten zu selektieren. Die Doppelmutanten werden visuell oder mithilfe von Bildanalysesoftware auf SSL-Interaktionen untersucht, indem die Größe der resultierenden Kolonien beurteilt wird.

Replikation von Hefekolonien während der SGA-Analyse mit Hilfe des ROTOR+ High Density Arraying Pinning-Roboters (Singer Instruments).

Robotik

Aufgrund der zahlreichen präzisen Replikationsschritte in der SGA-Analyse werden Roboter häufig für die Koloniemanipulation eingesetzt. Es gibt einige speziell für die SGA-Analyse entwickelte Systeme, die die Analysezeit eines bestimmten Gens erheblich verkürzen. Diese Systeme verfügen in der Regel über mehrere Nadeln zum Transfer von Zellen auf und von den Platten. Ein System verwendet Einweg-Nadelpads, um Waschzyklen zu vermeiden. Computerprogramme analysieren die Koloniegrößen anhand von Bildern der Platten und automatisieren so die SGA-Bewertung und das chemisch-genetische Profiling.

Schritte für ein genomweites genetisches Screening-System mit hohem Hefegehalt (SGA-Roadmap)

Es gibt sechs Hauptkomponenten:

  1. Mutantensammlung
  2. Material und Werkzeuge für den Umgang mit den Mutanten
  3. Bildanalysesystem
  4. Automatisches Quantifizierungs- und Bewertungssystem
  5. Bestätigungsansätze
  6. Datenanalyse-Tools

Siehe auch

Referenzen

  1. Tong , AHY; Evangelista, M.; Parsons, AB; Xu, H.; Bader, GD; Pagé, N.; Robinson, M.; Raghibizadeh, S.; Hogue, CW; Bussey, H.; Andrews, B.; Tyers, M.; Boone, C. (2001). „Systematische genetische Analyse mit geordneten Arrays von Hefe-Deletionsmutanten“. Science . 294 ( 5550 ) : 2364–2368 . Bibcode : 2001Sci...294.2364T . doi : 10.1126/science.1065810 . PMID 11743205. S2CID 6505287 .  
  2. ^ Tong, AHY; Lesage, G.; Bader, GD; Ding, H.; Xu, H.; Xin, X.; Young, J.; Berriz, GF; Brost, RL; Chang, M.; Chen, Y.; Cheng, X.; Chua, G.; Friesen, H.; Goldberg, DS; Haynes, J.; Humphries, C.; He, G.; Hussein, S.; Ke, L.; Krogan, N.; Li, Z.; Levinson, JN; Lu, H.; Ménard, P.; Munyana, C.; Parsons, AB; Ryan, O.; Tonikian, R.; Roberts, T. (2004). „Globale Kartierung des genetischen Interaktionsnetzwerks der Hefe“. Science . 303 (5659): 808–813 . Bibcode : 2004Sci...303..808T . doi : 10.1126/ science.1091317 . PMID 14764870. S2CID 11465508 .  
  3. ^ Costanzo, M.; Baryshnikova, A.; Bellay, J.; Kim, Y.; Speer, ED; Sevier, CS; Ding, H.; Koh, JLY; Toufighi, K.; Mostafavi, S.; Prinz, J.; St. Onge, RP; Vandersluis, B.; Makhnevych, T.; Vizeacoumar, FJ; Alizadeh, S.; Bahr, S.; Brost, RL; Chen, Y.; Cokol, M.; Deshpande, R.; Li, Z.; Lin, Z. -Y.; Liang, W.; Marback, M.; Pfote, J.; San Luis, B.-J.; Shuteriqi, E.; Tong, AHY; Van Dyk, N. (2010). „Die genetische Landschaft einer Zelle“ . Wissenschaft . 327 (5964): 425–431 . Bibcode : 2010Sci...327..425C . doi : 10.1126/ science.1180823 . PMC 5600254. PMID 20093466 .  
  4. ^ Roguev, A.; Wiren, M.; Weissman, JS; Krogan, NJ (2007). „Hochdurchsatz-Kartierung genetischer Interaktionen in der Spaltpilzart Schizosaccharomyces pombe“. Nature Methods . 4 (10): 861–866 . doi : 10.1038/nmeth1098 . PMID 17893680. S2CID 21870145 .  
  5. Dixon , SJ; Fedyshyn, Y; Koh, JLY; Prasad, TSK; Chahwan, C; Chua, G; Toufighi, K; Baryshnikova, A; Hayles, J; Hoe, K.-L.; Kim, D.-U.; Park, H.-O.; Myers, CL; Pandey, A.; Durocher, D.; Andrews, BJ; Boone, C. (2008). „Signifikante Konservierung synthetisch letaler genetischer Interaktionsnetzwerke zwischen entfernt verwandten Eukaryoten“ . Proceedings of the National Academy of Sciences . 105 (43): 16653–16658 . Bibcode : 2008PNAS..10516653D . doi : 10.1073/pnas.0806261105 . PMC 2575475 . PMID 18931302 .  
  6. ^ Typas, A.; Nichols, RJ; Siegele, DA; Shales, M.; Collins, SR; Lim, B.; Braberg, H.; Yamamoto, N.; Takeuchi, R.; Wanner, BL; Mori, H.; Weissman, JS; Krogan, NJ; Gross, CA (2008). „Hochdurchsatz-quantitative Analysen genetischer Interaktionen in E. coli“ . Nature Methods . 5 (9): 781–787 . doi : 10.1038/nmeth.1240 . PMC 2700713. PMID 19160513 .  
  7. ^ Butland, G.; Babu, M.; Díaz-Mejía, JJ; Bohdana, F.; Phanse, S.; Gold, B.; Yang, W.; Li, J.; Gagarinova, AG; Pogoutse, O.; Mori, H.; Wanner, BL; Lo, H.; Wasniewski, J.; Christopolous, C.; Ali, M.; Venn, P.; Safavi-Naini, A.; Sourour, N.; Caron, S.; Choi, JY; Laigle, L.; Nazarians-Armavil, A.; Deshpande, A.; Joe, S.; Datsenko, KA; Yamamoto, N.; Andrews, BJ; Boone, C.; Ding, H. (2008). „ESGA: Analyse synthetischer genetischer Arrays von E. Coli“. Naturmethoden . 5 (9): 789–795 . doi : 10.1038 / nmeth.1239 . PMID 18677321. S2CID 205418664 .  
  8. ^ " Saccharomyces Genome Deletion Project" .
  9. ^ „Hefe-Knockout-Stämme“ . Open Biosystems . Archiviert vom Original am 19. November 2011.