Nonsense-Mutation

In der Genetik bezeichnet man als Nonsense-Mutation eine Punktmutation in einer DNA- Sequenz , die zu einem Nonsense-Codon oder einem vorzeitigen Stoppcodon in der transkribierten mRNA führt und ein verkürztes, unvollständiges und möglicherweise funktionsloses Protein zur Folge hat . ^{[ 1 ]} Nonsense-Mutationen sind nicht immer schädlich; ^{[ 2 ]} die funktionelle Auswirkung einer Nonsense-Mutation hängt von vielen Faktoren ab, beispielsweise von der Position des Stoppcodons innerhalb der codierenden DNA . ^{[ 2 ]} So hängt die Auswirkung einer Nonsense-Mutation beispielsweise von der Nähe der Mutation zum ursprünglichen Stoppcodon und dem Ausmaß der Beeinträchtigung funktioneller Subdomänen des Proteins ab. ^{[ 3 ]} Da Nonsense-Mutationen zum vorzeitigen Abbruch von Polypeptidketten führen , werden sie auch als Kettenabbruchmutationen bezeichnet. ^{[ 4 ]}

Missense-Mutationen unterscheiden sich von Nonsense-Mutationen dadurch, dass es sich um Punktmutationen handelt , bei denen ein einzelnes Nukleotid ausgetauscht wird und dadurch eine andere Aminosäure entsteht . Eine Nonsense-Mutation unterscheidet sich auch von einer Nonstop-Mutation , die als Punktmutation ein Stoppcodon entfernt. Etwa 10 % der Patienten mit genetischen Erkrankungen weisen Nonsense-Mutationen auf. ^{[ 5 ]} Zu den Erkrankungen, die durch diese Mutationen verursacht werden können, gehören die Duchenne-Muskeldystrophie (DMD), Mukoviszidose (CF), ^{[ 6 ]} spinale Muskelatrophie (SMA), Krebs , Stoffwechselerkrankungen und neurologische Störungen. ^{[ 5 ] [ 7 ]} Die Häufigkeit von Nonsense-Mutationen variiert von Gen zu Gen und von Gewebe zu Gewebe, jedoch kommt es bei jedem Patienten mit einer Nonsense-Mutation zu einer Genstilllegung. ^{[ 5 ]}

DNA : 5′—ATG ACT CAC CGA GCG CGA AGC TGA—3′ 3′—TAC TGA GTG GCT CGC GCT TCG ACT—5′ mRNA : 5′—AUG ACU CAC CGA GCG CGA AGC UGA—3′ Protein: N— Met Thr His Arg Ala Arg Ser Stop —C 

Das obige Beispiel beginnt mit einer 5'- DNA-Sequenz mit 24 Nukleotiden (8 Triplett-Codons) und ihrem komplementären Strang (siehe unten). Die nächste Zeile zeigt den 5'- mRNA- Strang, der durch Transkription entsteht . Die letzte Zeile zeigt, welche Aminosäuren von den jeweiligen Codons translatiert werden , wobei das achte und letzte Codon das Stoppcodon darstellt . Die Codons für die vierte Aminosäure, Arginin (Arg), sind hervorgehoben, da sie in der folgenden Abbildung dieses Beispiels eine Nonsense-Mutation erfahren.

DNA : 5‘ – ATG ACT CAC T GA GCG CGA AGC TGA – 3‘ 3′—TAC TGA GTG A CT CGC GCT TCG ACT—5′ mRNA : 5′—AUG ACU CAC U GA GCG CGU AGC UGA—3′ Protein: N— Met Thr His Stop —C 

Angenommen, es wird eine Nonsense-Mutation am vierten Codon der 5′-DNA-Sequenz (CGA) eingeführt, wodurch Cytosin durch Thymin ersetzt wird . Dies führt zu TGA in der 5′-DNA-Sequenz und ACT im komplementären Strang. Da ACT als UGA transkribiert wird, wird es als Stoppcodon translatiert. Dadurch werden die verbleibenden Codons der mRNA nicht in Protein übersetzt, da das Stoppcodon während der Translation vorzeitig erreicht wird. Dies kann zu einem verkürzten Proteinprodukt führen, dem häufig die Funktionalität des normalen, nicht-mutierten Proteins fehlt . ^{[ 1 ]}

Schädliche Folgen stellen die Mehrzahl der Nonsense-Mutationen dar und sind die am häufigsten natürlich beobachtete Folge. Schädliche Nonsense-Mutationen verringern die allgemeine Fitness und den Fortpflanzungserfolg des Organismus . ^{[ 8 ]} Beispielsweise kann eine Nonsense-Mutation in einem Gen , das für ein Protein kodiert, strukturelle oder funktionelle Defekte in diesem Protein verursachen, die die Zellbiologie stören. Je nach Bedeutung der Funktionen dieses Proteins kann diese Störung die Fitness und das Überleben des Organismus erheblich beeinträchtigen. ^{[ 8 ]}

Wenn eine Nonsense-Mutation neutral ist, hat sie weder Vor- noch Nachteile. Dies ist der Fall, wenn die Auswirkungen der Mutation unbemerkt bleiben. Anders ausgedrückt: Die Mutation beeinflusst den Organismus weder positiv noch negativ. Da dieser Effekt unbemerkt bleibt, gibt es nur wenige Veröffentlichungen, die solche Mutationen beschreiben. Ein Beispiel für eine solche Nonsense-Mutation ist eine Mutation, die direkt vor dem ursprünglichen Stoppcodon des betreffenden Proteins auftritt. ^{[ 8 ]} Da diese Mutation so nah am Ende der Proteinkette auftritt, ist ihre Auswirkung möglicherweise nicht so bedeutend. Dies deutet darauf hin, dass die mutierte Aminosäure keinen großen Einfluss auf die Gesamtstruktur oder Funktion des Proteins oder des gesamten Organismus hat. Dieses Szenario ist selten, aber möglich. ^{[ 8 ]}

Vorteilhafte Nonsense-Mutationen gelten als die seltensten möglichen Folgen von Nonsense-Mutationen. Sie erhöhen die allgemeine Fitness und den Fortpflanzungserfolg eines Organismus, im Gegensatz zu den Auswirkungen schädlicher Mutationen. ^{[ 2 ] [ 8 ]} Da eine Nonsense-Mutation ein vorzeitiges Stoppcodon in eine DNA-Sequenz einführt, ist es äußerst unwahrscheinlich, dass dies dem Organismus tatsächlich zugutekommt. ^{[ 1 ]} Ein Beispiel hierfür wäre eine Nonsense-Mutation, die ein funktionsloses, Toxine freisetzendes Protein betrifft . Das durch diese Mutation verursachte Stoppcodon würde verhindern, dass dieses Protein seine Funktion ordnungsgemäß ausführt. Dadurch, dass das Protein nicht mehr seine volle Wirkung entfalten kann, wird weniger Toxin freigesetzt, und die Fitness des Organismus verbessert sich. Solche Situationen mit Nonsense-Mutationen treten deutlich seltener auf als schädliche Folgen. ^{[ 8 ]}

Nonsense-vermittelter mRNA-Abbau

Obwohl man erwarten würde, dass vorzeitige Stoppcodons zu verkürzten Polypeptidprodukten führen, kommt die Bildung verkürzter Proteine ​​in vivo tatsächlich selten vor . Viele Organismen – darunter Menschen und niedere Arten wie Hefen – nutzen den Nonsense-vermittelten mRNA- Abbauweg, der mRNAs mit Nonsense-Mutationen abbaut, bevor sie in nicht-funktionelle Polypeptide translatiert werden können.

tRNA-Suppression

Da Nonsense-Mutationen zu veränderter mRNA mit einem vorzeitigen Stoppcodon führen, kann die Schädigung der Proteinfunktion durch die Veränderung der mRNA-lesenden tRNA verhindert werden. Diese tRNAs werden als Suppressor-tRNAs bezeichnet . Ist das Stoppcodon UAG, kann jede andere Aminosäure-tRNA von ihrem ursprünglichen Anticodon zu AUC verändert werden, sodass sie stattdessen das UAG-Codon erkennt. Dadurch wird das Protein nicht verkürzt, kann aber dennoch eine veränderte Aminosäure enthalten. Solche Suppressor-tRNA-Mutationen sind nur möglich, wenn die Zelle über mehr als eine tRNA verfügt, die ein bestimmtes Codon liest; andernfalls würde die Mutation zum Zelltod führen. Die einzigen Stoppcodons sind UAG, UAA und UGA. UAG- und UAA-Suppressoren lesen ihre jeweiligen Stoppcodons anstelle ihres ursprünglichen Codons, UAA-Suppressoren lesen aufgrund der Wobble-Basenpaarung zusätzlich auch UAG . UGA-Suppressoren sind sehr selten. Eine weitere Hürde dieser Technik besteht darin, dass Stoppcodons auch von Freisetzungsfaktoren erkannt werden . Die tRNA muss daher weiterhin mit den Freisetzungsfaktoren konkurrieren, um die Translation aufrechtzuerhalten. Aus diesem Grund ist die Suppression üblicherweise nur in 10–40 % der Fälle erfolgreich. Diese Suppressor-tRNA-Mutationen zielen auch auf Stoppcodons ab, die keine Mutationen darstellen, wodurch manche Proteine ​​deutlich länger werden als vorgesehen. Nur Bakterien und niedere Eukaryoten können mit diesen Mutationen überleben; Säugetier- und Insektenzellen sterben infolge einer Suppressormutation ab. ^{[ 4 ]}

Aus historischen Gründen wurden den drei Stoppcodons Namen gegeben (siehe Stoppcodons ): UAG wird als Amber-Codon bezeichnet, UAA als Ocker-Codon und UGA als Opal-Codon. ^{[ 10 ]}

Nonsense-Mutationen machen etwa 20 % der Einzelnukleotid-Substitutionen in proteinkodierenden Sequenzen aus, die zu menschlichen Erkrankungen führen. ^{[ 12 ]} Die durch Nonsense-Mutationen bedingte Pathologie wird häufig auf eine reduzierte Menge an vollständigem Protein zurückgeführt, da nur 5–25 % der Transkripte mit Nonsense-Mutationen nicht dem Nonsense-vermittelten mRNA-Abbau (NMD) unterliegen. ^{[ 13 ] [ 12 ]} Die Translation der verbleibenden, Nonsense-tragenden mRNA kann verkürzte Proteinvarianten mit toxischen Wirkungen erzeugen. ^{[ 14 ]}

Dreiundzwanzig verschiedene Einzelpunkt-Nukleotidsubstitutionen können ein Nonsense-Codon in ein Stoppcodon umwandeln. Die Mutationen CGA TGA und CAG TAG sind die häufigsten krankheitsrelevanten Substitutionen, die in der Human Gene Mutation Database (HGMD) erfasst sind. ^{[ 12 ]} Aufgrund unterschiedlicher Substitutionshäufigkeiten der einzelnen Nukleotide unterscheiden sich die Anteile der drei durch krankheitsverursachende Nonsense-Mutationen generierten Stoppcodons von der Stoppcodonverteilung in nicht-krankheitsrelevanten Genvarianten. ^{[ 12 ]} Auffällig ist, dass das Codon TAG überrepräsentiert, die Codons TGA und TAA hingegen unterrepräsentiert sind. ^{[ 12 ]}${\displaystyle \longrightarrow }$${\displaystyle \longrightarrow }$

Die Effizienz des Translationsabbruchs wird durch die spezifische Stoppcodonsequenz auf der mRNA beeinflusst, wobei die UAA-Sequenz den höchsten Abbruch bewirkt. ^{[ 15 ]} Auch die Sequenzen um das Stoppcodon herum beeinflussen die Abbrucheffizienz. ^{[ 15 ]} Folglich hängt die zugrunde liegende Pathologie von Erkrankungen, die durch Nonsense-Mutationen verursacht werden, letztendlich von der Identität des mutierten Gens und der spezifischen Position der Mutation ab.

Beispiele für Krankheiten, die durch Nonsense-Mutationen hervorgerufen werden, sind:

• Zystische Fibrose (verursacht durch die G542X-Mutation im Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR))
• Beta-Thalassämie (β-Globin)
• Hurler-Syndrom
• Dravet-Syndrom
• Usher-Syndrom

Auch Nonsense-Mutationen in anderen Genen können zu Funktionsstörungen verschiedener Gewebe oder Organsysteme führen:

SMAD8

SMAD8 ist das achte Homolog der ENDOGLIN-Genfamilie und an der Signalübertragung zwischen TGF-β und BMP beteiligt . Neuartige Nonsense-Mutationen in SMAD8 wurden mit pulmonaler arterieller Hypertonie in Verbindung gebracht. ^{[ 16 ]} Das pulmonale System ist auf SMAD1, SMAD5 und SMAD8 angewiesen, um die pulmonale Gefäßfunktion zu regulieren. Die Herunterregulierung und der Verlust von Signalen, die normalerweise von SMAD8 vermittelt werden, tragen zur Pathogenese der pulmonalen arteriellen Hypertonie bei. ^{[ 16 ]} Es wurde festgestellt, dass das ALK1 -Gen, ein Mitglied der TGF-β-Signalfamilie, bei Patienten mit pulmonaler arterieller Hypertonie mutiert ist und gleichzeitig das SMAD8-Gen herunterreguliert. ^{[ 16 ]} SMAD8-Mutanten werden nicht durch ALK1 phosphoryliert , wodurch die Interaktionen mit SMAD4 gestört werden, die normalerweise die Signalübertragung in Wildtyp- Organismen ermöglichen . ^{[ 16 ]}

LGR4 bindet R-Spondine und aktiviert dadurch den Wnt-Signalweg . ^{[ 17 ]} Der Wnt-Signalweg reguliert die Knochenmasse und die Osteoblastendifferenzierung und ist wichtig für die Entwicklung von Knochen, Herz und Muskeln. ^{[ 17 ]} Eine Nonsense-Mutation im LGR4-Gen wurde in einer gesunden Population mit einer niedrigen Knochendichte und Osteoporose- Symptomen in Verbindung gebracht . Bei LGR4- Mutantenmäusen konnte gezeigt werden, dass die beobachtete niedrige Knochenmasse nicht auf altersbedingten Knochenverlust zurückzuführen ist. ^{[ 17 ]} Mutationen im LGR4-Gen wurden mit familiärer Häufung seltener Knochenerkrankungen assoziiert. ^{[ 17 ]} Wildtyp-Mäuse ohne LGR4 zeigten ebenfalls eine verzögerte Osteoblastendifferenzierung während der Entwicklung, was die wichtige Rolle von LGR4 in der Knochenmassenregulation und -entwicklung unterstreicht. ^{[ 17 ]}

Therapeutische Ansätze für Erkrankungen, die durch Nonsense-Mutationen verursacht werden, zielen darauf ab, die Funktion des Wildtyps wiederherzustellen, indem sie die Effizienz des NMD verringern, das Überlesen des vorzeitigen Stoppcodons während der Translation erleichtern oder die genomische Nonsense-Mutation editieren. ^{[ 18 ]}

Antisense-Oligonukleotide zur Unterdrückung der Expression von NMD- und Translationsterminationsproteinen werden in Tiermodellen für durch Nonsense-Mutationen verursachte Erkrankungen untersucht. ^{[ 18 ] [ 19 ]} Weitere RNA-Therapeutika, die derzeit erforscht werden, umfassen synthetische Suppressor-tRNAs, die es Ribosomen ermöglichen , beim Auftreten vorzeitiger Stoppcodons eine Aminosäure einzufügen, anstatt die Kettenabbruchreaktion einzuleiten. ^{[ 18 ]}

Mithilfe von CRISPR-Cas9 wurden Einzelnukleotid-Substitutionen durchgeführt, um Aminosäure-Codons aus Stopp-Codons zu erzeugen. In Zellkulturen wurde dabei eine Editierungserfolgsrate von 10 % erreicht. ^{[ 20 ]}

Das Überlesen von Stoppcodons wurde bereits mit niedermolekularen Wirkstoffen wie Aminoglykosiden und Negamycin erreicht . [ 18 ] Das Oxadiazol Ataluren ( früher ^{PTC124 ) ermöglicht} das selektive Überlesen aberranter Stoppcodons und stellt somit ein potenzielles Therapeutikum gegen durch Nonsense-Mutationen verursachte Erkrankungen dar. ^{[ 21 ]} Ataluren, das unter dem Handelsnamen Translarna vertrieben wird, ist derzeit in der Europäischen Union und in Brasilien zur Behandlung der Duchenne-Muskeldystrophie zugelassen . ^{[ 22 ] [ 23 ]} Allerdings erreichten Phase-III-Studien mit Ataluren als Therapeutikum für Mukoviszidose ihre primären Endpunkte nicht. ^{[ 24 ] [ 25 ]}

• Emily's Entourage , eine gemeinnützige Organisation für Mukoviszidose, die Nonsense-Mutationen erforscht
• Missense-Mutation
• Unsinnunterdrücker
• Proteinverkürzende Varianten

• Stiftung für Nonsense-Mutationen , die Patienten mit Nonsense-Mutationen in allen Genen unterstützt