Zusammenfassung der RNA-Sequenzierung. Innerhalb des Organismus werden Gene transkribiert und (in eukaryotischen Organismen ) gespleißt, um reife mRNA-Transkripte (rot) zu erzeugen. Die mRNA wird aus dem Organismus extrahiert, fragmentiert und in stabile doppelsträngige cDNA (blau) umgeschrieben. Die ds-cDNA wird mittels Hochdurchsatz -Sequenzierung mit kurzen Leselängen sequenziert. Diese Sequenzen können anschließend mit einer Referenzgenomsequenz abgeglichen werden , um zu rekonstruieren, welche Genomregionen transkribiert wurden. Diese Daten können verwendet werden, um die Lokalisation exprimierter Gene, ihre relative Expressionsstärke und alternative Spleißvarianten zu annotieren. [ 1 ]

RNA-Seq (kurz für RNA-Sequenzierung ) ist eine Sequenzierungstechnik der nächsten Generation (Next-Generation Sequencing, NGS), die zur Quantifizierung und Identifizierung von RNA- Molekülen in einer biologischen Probe dient und eine Momentaufnahme des Transkriptoms zu einem bestimmten Zeitpunkt liefert. [ 2 ] Sie ermöglicht die Analyse des gesamten Transkriptoms durch Sequenzierung von aus RNA gewonnener cDNA . [ 3 ] Moderne Arbeitsabläufe integrieren häufig Pseudoalignment-Tools (wie Kallisto und Salmon) und cloudbasierte Verarbeitungspipelines, wodurch Geschwindigkeit, Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit verbessert werden.

RNA-Seq ermöglicht die Untersuchung von alternativen Spleißvarianten , posttranskriptionellen Modifikationen , Genfusionen , Mutationen/ SNPs und Veränderungen der Genexpression im Zeitverlauf sowie von Unterschieden in der Genexpression zwischen verschiedenen Gruppen oder nach unterschiedlichen Behandlungen. [ 4 ] Neben mRNA-Transkripten kann RNA-Seq verschiedene RNA-Populationen analysieren, darunter Gesamt-RNA, kleine RNAs wie miRNA und tRNA sowie ribosomale Profile . [ 5 ] RNA-Seq kann außerdem zur Bestimmung von Exon- / Intron -Grenzen und zur Überprüfung oder Korrektur zuvor annotierter 5'- und 3'- Gengrenzen eingesetzt werden . Zu den jüngsten Fortschritten in der RNA-Sequenzierung zählen Einzelzellsequenzierung , Bulk-RNA-Sequenzierung [ 6 ] , 3'-mRNA-Sequenzierung , In-situ -Sequenzierung von fixiertem Gewebe und native RNA-Molekülsequenzierung [ 7 ] mit Einzelmolekül-Echtzeitsequenzierung [ 8 ] . Weitere Beispiele für neue RNA-Seq-Anwendungen, die auf die Weiterentwicklung bioinformatischer Algorithmen zurückzuführen sind, sind Kopienzahlveränderungen, mikrobielle Kontamination, transponierbare Elemente, Zelltypbestimmung (Dekonvolution) und das Vorhandensein von Neoantigenen [ 9 ] .

Geschichte

Die Treffer in PubMed unterstreichen die wachsende Popularität von RNA-Seq. Die Treffer beziehen sich auf RNA-Seq (blau, Suchbegriffe: „RNA Seq“ ODER „RNA-Seq“ ODER „RNA-Sequenzierung“ ODER „RNASeq“) [ 10 ] und RNA-Seq in der Medizin (gold, Suchbegriffe: („RNA Seq“ ODER „RNA-Seq“ ODER „RNA-Sequenzierung“ ODER „RNASeq“) UND „Medizin“). [ 11 ] Die Anzahl der in PubMed verfügbaren Manuskripte, die RNA-Seq behandeln, steigt weiterhin.

Vor der Einführung von RNA-Seq wurden Genexpressionsstudien mit Hybridisierungs-basierten Mikroarrays durchgeführt . Zu den Problemen von Mikroarrays zählen Kreuzhybridisierungsartefakte, die ungenaue Quantifizierung schwach und stark exprimierter Gene sowie die Notwendigkeit, die Sequenz a priori zu kennen . [ 12 ] Aufgrund dieser technischen Schwierigkeiten vollzog die Transkriptomik den Übergang zu Sequenzierungsmethoden. Diese entwickelten sich von der Sanger-Sequenzierung von EST- Bibliotheken über chemische Tag-basierte Methoden (z. B. serielle Genexpressionsanalyse ) bis hin zur heutigen Technologie, der Next-Generation-Sequenzierung von cDNA , insbesondere RNA-Seq Mitte der 2000er Jahre. [ 13 ]

Die ersten Manuskripte, die RNA-Seq verwendeten, ohne den Begriff selbst zu verwenden, umfassen Studien zu Prostatakrebszelllinien [ 14 ] ( 2006), Medicago truncatula [ 15 ] (2006) und Mais [ 16 ] (2007), während der Begriff „RNA-Seq“ erst 2008 erwähnt wurde. [ 7 ] [ 17 ] [ 18 ] Die Anzahl der Manuskripte, die RNA-Seq im Titel oder Abstract erwähnen (Abbildung, blaue Linie), steigt kontinuierlich an; 2018 wurden 6754 Manuskripte veröffentlicht. Die Schnittstelle zwischen RNA-Seq und Medizin (Abbildung, goldene Linie) entwickelt sich ähnlich rasant. [ 19 ]

Methoden

Bibliotheksvorbereitung

Typischer experimenteller Arbeitsablauf für RNA-Seq. RNA wird aus mehreren Proben isoliert, in cDNA-Bibliotheken umgewandelt, in ein computerlesbares Format sequenziert, mit einer Referenzsequenz abgeglichen und für nachfolgende Analysen wie differentielle Genexpression und alternatives Spleißen quantifiziert. Übersicht über einen typischen experimentellen Arbeitsablauf für RNA-Seq. [ 20 ]

Die allgemeinen Schritte zur Erstellung einer komplementären DNA (cDNA)-Bibliothek für die Sequenzierung werden im Folgenden beschrieben, variieren jedoch häufig je nach Plattform. [ 20 ] [ 3 ] [ 21 ]

  1. RNA-Isolierung: RNA wird aus Gewebe isoliert und mit Desoxyribonuklease (DNase) versetzt. DNase reduziert die Menge an genomischer DNA. Der RNA-Abbau wird mittels Gel- und Kapillarelektrophorese überprüft und dient zur Bestimmung der RNA-Integritätszahl (RIN) der Probe. Diese RNA-Qualität und die Gesamtmenge der Ausgangs-RNA werden bei der nachfolgenden Bibliothekspräparation, Sequenzierung und Analyse berücksichtigt.
  2. RNA-Selektion/-Abreicherung: Zur Analyse von Signalen von Interesse kann die isolierte RNA entweder unverändert bleiben, mit RNA mit 3'-Poly(A) -Schwänzen angereichert werden, um ausschließlich eukaryotische mRNA einzuschließen , von ribosomaler RNA (rRNA) abgereichert werden und/oder nach RNA gefiltert werden, die spezifische Sequenzen bindet (siehe Tabelle „Methoden zur RNA-Selektion und -Abreicherung“ weiter unten). RNA-Moleküle mit 3'-Poly(A)-Schwänzen in Eukaryoten bestehen hauptsächlich aus reifen, prozessierten, codierenden Sequenzen. Die Poly(A)-Selektion erfolgt durch Mischen von RNA mit Poly(T)-Oligomeren, die kovalent an ein Substrat, typischerweise magnetische Beads, gebunden sind. [ 22 ] [ 17 ] Die Poly(A)-Selektion weist jedoch wichtige Einschränkungen bei der Detektion von RNA-Biotypen auf. Viele RNA-Biotypen sind nicht polyadenyliert, darunter viele nicht-kodierende RNA- und Histonkernprotein- Transkripte , oder werden über die Länge ihres Poly(A)-Schwanzes reguliert (z. B. Zytokine) und sind daher nach Poly(A)-Selektion möglicherweise nicht nachweisbar. [ 23 ] Darüber hinaus kann die Poly(A)-Selektion, insbesondere bei RNA geringerer Qualität, eine erhöhte 3'-Bias aufweisen. [ 24 ] [ 25 ] Diese Einschränkungen lassen sich durch ribosomale Depletion umgehen, wodurch rRNA entfernt wird, die typischerweise über 90 % der RNA in einer Zelle ausmacht. Sowohl die Poly(A)-Anreicherung als auch die ribosomale Depletion sind arbeitsintensiv und können zu Verzerrungen führen, weshalb einfachere Verfahren entwickelt wurden, um diese Schritte zu umgehen. [ 26 ] Kleine RNA-Targets wie miRNA können anschließend durch Größenselektion mittels Ausschlussgelen, Magnetbeads oder kommerziellen Kits isoliert werden.
  3. cDNA-Synthese: RNA wird in cDNA umgeschrieben , da DNA stabiler ist und die Amplifikation (mittels DNA-Polymerasen ) sowie die Nutzung ausgereifterer DNA-Sequenzierungstechnologien ermöglicht werden. Die Amplifikation nach der reversen Transkription führt zum Verlust der Strangspezifität , was durch chemische Markierung oder Einzelmolekülsequenzierung vermieden werden kann. Fragmentierung und Größenselektion dienen der Reinigung von Sequenzen mit der für das Sequenziergerät geeigneten Länge. Die Fragmentierung von RNA, cDNA oder beidem erfolgt enzymatisch, durch Ultraschall , zweiwertige Ionen oder mittels Zerstäuber. Die RNA-Fragmentierung reduziert die 5'-Präferenz bei der reversen Transkription mit zufälligen Primern und den Einfluss von Primerbindungsstellen [ 17 ] , allerdings mit dem Nachteil, dass die 5'- und 3'-Enden weniger effizient in DNA umgewandelt werden. Im Anschluss an die Fragmentierung erfolgt die Größenselektion, bei der entweder kurze Sequenzen entfernt oder ein enger Längenbereich ausgewählt wird. Da kleine RNAs wie miRNAs verloren gehen, werden diese separat analysiert. Die cDNA für jedes Experiment kann mit einem Hexamer- oder Oktamer-Barcode indexiert werden, sodass diese Experimente für die Multiplex-Sequenzierung in einer einzigen Spur zusammengefasst werden können.
RNA-Selektions- und -Abreicherungsmethoden: [ 20 ]
StrategieVorherrschender RNA-Typribosomaler RNA-GehaltUnverarbeiteter RNA-GehaltIsolierungsmethode
Gesamt-RNAAlleHochHochKeiner
PolyA-AuswahlCodierungNiedrigNiedrigHybridisierung mit Poly(dT) -Oligomeren
rRNA-VerarmungProgrammieren, Nicht-ProgrammierenNiedrigHochEntfernung von Oligomeren, die komplementär zu rRNA sind
RNA-ErfassungGezieltNiedrigMäßigHybridisierung mit Sonden, die komplementär zu den gewünschten Transkripten sind

Komplementäre DNA-Sequenzierung (cDNA-Seq)

Die aus RNA-Biotypen gewonnene cDNA-Bibliothek wird anschließend in ein computerlesbares Format sequenziert. Für die cDNA-Sequenzierung stehen zahlreiche Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien zur Verfügung, darunter Plattformen von Illumina , Thermo Fisher , BGI/MGI , PacBio und Oxford Nanopore Technologies . [ 27 ] Bei der Illumina-Kurzsequenzierung, einer gängigen Technologie für die cDNA-Sequenzierung, werden Adapter an die cDNA ligiert, die DNA an eine Durchflusszelle gebunden, Cluster durch Zyklen von Brückenamplifikation und Denaturierung generiert und die Sequenzierung durch Synthese in Zyklen von komplementärer Strangsynthese und Laseranregung von Basen mit reversiblen Terminatoren durchgeführt. Die Wahl der Sequenzierungsplattform und ihrer Parameter richtet sich nach dem Versuchsaufbau und den Kosten. Zu den gängigen Überlegungen beim Versuchsaufbau gehören die Festlegung der Sequenzierlänge, der Sequenziertiefe, der Verwendung von Einzel- oder Paarendsequenzierung, der Anzahl der Replikate, des Multiplexings, der Randomisierung und des Spike-ins . [ 28 ]

First, cellular mRNA is extracted and fragmented into smaller mRNA sequences, which undergo reverse transcription. The resulting cDNAs are sequenced on a Next Generation Sequencing (NGS) platform. The results of such sequencing allow the generation of transcriptomic sequencing genomic maps.
Experimentelle Transkriptomsequenzierungstechnik (RNA-Seq).

Sequenzierung kleiner RNA/nicht-kodierender RNA

Bei der Sequenzierung anderer RNA als mRNA wird die Bibliothekspräparation angepasst. Die zelluläre RNA wird anhand des gewünschten Größenbereichs ausgewählt. Für kleine RNA-Zielmoleküle wie miRNA wird die RNA durch Größenselektion isoliert. Dies kann mittels Größenausschlussgel, magnetischen Selektionsbeads oder einem kommerziellen Kit erfolgen. Nach der Isolierung werden Linker an das 3'- und 5'-Ende angefügt und die RNA anschließend aufgereinigt. Der letzte Schritt ist die cDNA- Synthese durch reverse Transkription.

Direkte RNA-Sequenzierung

Da die Umwandlung von RNA in cDNA , Ligation, Amplifikation und andere Probenmanipulationen nachweislich zu Verzerrungen und Artefakten führen, die die korrekte Charakterisierung und Quantifizierung von Transkripten beeinträchtigen können [ 29 ] , wurde die direkte Einzelmolekül-RNA-Sequenzierung von Unternehmen wie Helicos (insolvent), Oxford Nanopore Technologies [ 30 ] und anderen erforscht. Diese Technologie sequenziert RNA-Moleküle direkt und massiv parallel.

Einzelmolekül-RNA-Sequenzierung in Echtzeit

Die massiv parallele Einzelmolekül-Direkt-RNA-Sequenzierung (SMI-RNA-Seq) wurde als Alternative zur traditionellen RNA-Sequenzierung erforscht, bei der die RNA-zu- cDNA- Konvertierung, Ligation, Amplifikation und andere Probenmanipulationsschritte zu Verzerrungen und Artefakten führen können. [ 31 ] Zu den Technologieplattformen für die Echtzeit-Einzelmolekül-RNA-Sequenzierung gehört die Nanoporensequenzierung von Oxford Nanopore Technologies (ONT) . [ 30 ] Die Sequenzierung von RNA in ihrer nativen Form erhält Modifikationen wie die Methylierung und ermöglicht deren direkte und simultane Untersuchung. [ 30 ] Ein weiterer Vorteil der Einzelmolekül-Direkt-RNA-Seq ist die vollständige Erfassung von Transkripten, was im Vergleich zur Kurzsequenzierung eine zuverlässigere Detektion und Quantifizierung von Isoformen ermöglicht. Traditionell weisen Einzelmolekül-RNA-Seq-Methoden höhere Fehlerraten als die Kurzsequenzierung auf, neuere Methoden wie die ONT-Direkt-RNA-Seq zeigen jedoch eine reduzierte Fehlerrate. Jüngste Anwendungen der ONT-Direkt-RNA-Sequenzierung zur differentiellen Genexpression in menschlichen Zellpopulationen haben gezeigt, dass diese Technologie viele Einschränkungen der Sequenzierung kurzer und langer cDNA-Sequenzen überwinden kann. [ 32 ]

Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-Seq)

Standardmethoden wie Microarrays und die Standard-Bulk-RNA-Seq-Analyse untersuchen die RNA-Expression großer Zellpopulationen. In gemischten Zellpopulationen können diese Messungen jedoch wichtige Unterschiede zwischen einzelnen Zellen innerhalb dieser Populationen verschleiern. [ 33 ] [ 34 ]

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) liefert Expressionsprofile einzelner Zellen. Obwohl aufgrund der geringen Materialmenge keine vollständigen Informationen über jede von jeder Zelle exprimierte RNA gewonnen werden können, lassen sich Genexpressionsmuster durch Genclusteranalysen identifizieren . Dies kann die Existenz seltener Zelltypen innerhalb einer Zellpopulation aufdecken, die zuvor möglicherweise unbekannt waren. Beispielsweise wurden 2018 von zwei Forschungsgruppen, die scRNA-Seq an Atemwegsepithelien der Lunge durchführten, seltene spezialisierte Zellen in der Lunge, sogenannte pulmonale Ionocyten, identifiziert , die den CFTR- Kanal (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) exprimieren . [ 35 ] [ 36 ]

Experimentelle Überlegungen

Bei der Planung und Durchführung von RNA-Seq-Experimenten werden verschiedene Parameter berücksichtigt:

  • Gewebespezifität: Die Genexpression variiert innerhalb und zwischen Geweben, und RNA-Seq erfasst diese Mischung verschiedener Zelltypen. Dies kann die Isolierung des relevanten biologischen Mechanismus erschweren. Einzelzellsequenzierung ermöglicht die Untersuchung jeder einzelnen Zelle und mindert so dieses Problem.
  • Zeitabhängigkeit: Die Genexpression verändert sich im Laufe der Zeit, und RNA-Seq liefert nur eine Momentaufnahme. Zeitaufgelöste RNA-Sequenzierungsmethoden können eingesetzt werden, um Veränderungen im Transkriptom zu beobachten.
  • Abdeckung (auch als Sequenziertiefe bezeichnet): RNA weist dieselben Mutationen wie DNA auf, weshalb für deren Nachweis eine höhere Abdeckung erforderlich ist. Bei ausreichend hoher Abdeckung kann RNA-Seq zur Abschätzung der Expression jedes Allels verwendet werden . Dies kann Einblicke in Phänomene wie Imprinting oder cis-regulatorische Effekte ermöglichen . Die für spezifische Anwendungen erforderliche Sequenziertiefe lässt sich aus einem Pilotexperiment ableiten. [ 37 ]
  • Datengenerierungsartefakte (auch als technische Varianz bezeichnet): Reagenzien (z. B. Kit zur Bibliothekspräparation), beteiligtes Personal und der Sequenziergerätetyp (z. B. Illumina , Pacific Biosciences ) können zu technischen Artefakten führen, die fälschlicherweise als aussagekräftige Ergebnisse interpretiert werden können. Wie bei jedem wissenschaftlichen Experiment ist es ratsam, RNA-Seq unter kontrollierten Bedingungen durchzuführen. Ist dies nicht möglich oder handelt es sich um eine Metaanalyse , besteht eine Alternative darin, technische Artefakte durch die Bestimmung latenter Variablen (typischerweise mittels Hauptkomponentenanalyse oder Faktorenanalyse ) und die anschließende Korrektur dieser Variablen zu erkennen . [ 38 ]
  • Datenmanagement: Ein einzelnes RNA-Seq-Experiment am Menschen umfasst üblicherweise 1–5 Gb (komprimiert), mit Zwischenspeicherdateien sogar noch mehr. [ 39 ] Dieses große Datenvolumen kann zu Speicherproblemen führen. Eine Lösung besteht in der Komprimierung der Daten mithilfe von Mehrzweck-Komprimierungsverfahren (z. B. gzip ) oder genomikspezifischen Verfahren. Letztere können auf Referenzsequenzen oder De-novo-Sequenzierung basieren. Alternativ können Microarray-Experimente durchgeführt werden, die für hypothesengetriebene Arbeiten oder Replikationsstudien (im Gegensatz zu explorativer Forschung) ausreichend sein können.

Analyse

Transkriptom-Assemblierung

Ein Standard-Workflow für die RNA-Seq-Analyse. Sequenzierte Reads werden an einem Referenzgenom und/oder -transkriptom ausgerichtet und anschließend für eine Vielzahl von Qualitätskontroll-, Entdeckungs- und hypothesengetriebenen Analysen verarbeitet.

Zur Zuordnung von Rohsequenzdaten zu genomischen Merkmalen (d. h. zur Assemblierung des Transkriptoms) werden zwei Methoden verwendet:

  • De novo: Dieser Ansatz benötigt kein Referenzgenom zur Rekonstruktion des Transkriptoms und wird typischerweise verwendet, wenn das Genom unbekannt, unvollständig oder im Vergleich zur Referenz stark verändert ist. [ 40 ] Herausforderungen bei der Verwendung kurzer Lesesequenzen für die De-novo-Assemblierung sind unter anderem: 1) die Bestimmung, welche Lesesequenzen zu zusammenhängenden Sequenzen ( Contigs ) verknüpft werden sollen , 2) die Robustheit gegenüber Sequenzierungsfehlern und anderen Artefakten sowie 3) die Recheneffizienz. Der primäre Algorithmus für die De-novo-Assemblierung hat sich von Überlappungsgraphen, die alle paarweisen Überlappungen zwischen Lesesequenzen identifizieren, zu De-Bruijn-Graphen weiterentwickelt . Letztere zerlegen Lesesequenzen in Sequenzen der Länge k und fassen alle k-Mer in einer Hashtabelle zusammen . [ 41 ] Überlappungsgraphen wurden bei der Sanger-Sequenzierung eingesetzt, skalieren aber nicht gut auf die Millionen von Lesesequenzen, die mit RNA-Seq generiert werden. Beispiele für Assembler, die De-Bruijn-Graphen verwenden, sind Trinity [ 40 ] , Oases [ 42 ] (abgeleitet vom Genom-Assembler Velvet [ 43 ] ), Bridger [ 44 ] und rnaSPAdes [ 45 ] . Die Sequenzierung von gepaarten und langen Lesesequenzen derselben Probe kann die Defizite der Kurzsequenzierung ausgleichen, indem sie als Vorlage oder Gerüst dient. Zu den Metriken zur Beurteilung der Qualität einer De-novo-Assemblierung gehören die mittlere Contig-Länge, die Anzahl der Contigs und der N50- Wert [ 46 ] .
RNA-Seq-Alignment mit Intron-gespaltenen Kurzsequenzen. Ausrichtung von Kurzsequenzen an einer mRNA-Sequenz und dem Referenzgenom. Die Alignment-Software muss Kurzsequenzen berücksichtigen, die Exon-Exon-Übergänge (rot) überlappen und dadurch intronische Abschnitte der Prä-mRNA und des Referenzgenoms überspringen.
  • Genomgestütztes Alignment: Dieser Ansatz basiert auf denselben Methoden wie das DNA-Alignment, jedoch mit der zusätzlichen Komplexität, Reads auszurichten, die nicht-kontinuierliche Abschnitte des Referenzgenoms abdecken. [ 47 ] Diese nicht-kontinuierlichen Reads entstehen durch die Sequenzierung gespleißter Transkripte (siehe Abbildung). Typischerweise bestehen Alignment-Algorithmen aus zwei Schritten: 1) Ausrichtung kurzer Abschnitte des Reads (d. h. Initialisierung des Genoms) und 2) Verwendung dynamischer Programmierung zur Ermittlung eines optimalen Alignments, gegebenenfalls in Kombination mit bekannten Annotationen. Software-Tools für das genomgestützte Alignment sind beispielsweise Bowtie [ 48 ] , TopHat (das auf den Ergebnissen von BowTie aufbaut, um Spleißstellen auszurichten) [ 49 ] [ 50 ] , Subread [ 51 ] , STAR [ 47 ] , HISAT2 [ 52 ] und GMAP. [ 53 ] Die Ergebnisse von Genom-gestützten Alignment-Tools (Mapping) können mithilfe von Tools wie Cufflinks [ 50 ] oder StringTie [ 54 ] weiterverwendet werden , um zusammenhängende Transkriptsequenzen ( d. h . eine FASTA-Datei) zu rekonstruieren. Die Qualität einer Genom-gestützten Assemblierung kann sowohl anhand von 1) De-novo-Assemblierungsmetriken (z. B. N50) als auch 2) durch Vergleiche mit bekannten Transkript-, Spleißstellen-, Genom- und Proteinsequenzen mithilfe von Präzision, Sensitivität oder deren Kombination (z. B. F1-Score) gemessen werden. [ 46 ] Zusätzlich kann eine In-silico -Bewertung mithilfe simulierter Reads durchgeführt werden. [ 55 ] [ 56 ]

Anmerkung zur Assemblierungsqualität: Derzeit herrscht Einigkeit darüber, dass 1) die Assemblierungsqualität je nach verwendetem Bewertungskriterium variieren kann, 2) Assemblierungswerkzeuge, die bei einer Spezies gute Ergebnisse erzielt haben, nicht unbedingt bei anderen Spezies gut funktionieren und 3) die Kombination verschiedener Ansätze möglicherweise die zuverlässigste Methode darstellt. [ 57 ] [ 58 ] [ 59 ]

Quantifizierung der Genexpression

Die Genexpression wird quantifiziert, um zelluläre Veränderungen als Reaktion auf externe Reize, Unterschiede zwischen gesunden und kranken Zuständen sowie weitere Forschungsfragen zu untersuchen. Transkriptspiegel werden häufig als Indikator für die Proteinmenge verwendet, sind aber aufgrund posttranskriptioneller Prozesse wie RNA-Interferenz und Nonsense-vermitteltem mRNA-Abbau oft nicht gleichwertig . [ 60 ]

Die Genexpression wird quantifiziert, indem die Anzahl der Reads gezählt wird, die im Transkriptom-Assemblierungsschritt jedem Locus zugeordnet wurden . Die Expression kann für Exons oder Gene mithilfe von Contigs oder Referenztranskript-Annotationen quantifiziert werden. [ 20 ] Diese beobachteten RNA-Seq-Read-Counts wurden anhand älterer Technologien, einschließlich Expressions-Microarrays und qPCR , umfassend validiert . [ 37 ] [ 61 ] Zu den Tools, die die Counts quantifizieren, gehören HTSeq [ 62 ] , FeatureCounts [ 63 ] , Rcount [ 64 ] , maxcounts [ 65 ] , FIXSEQ [ 66 ] und Cuffquant. Diese Tools bestimmen die Read-Counts aus alignierten RNA-Seq-Daten; alignierungsfreie Counts können jedoch auch mit Sailfish [ 67 ] und Kallisto [ 68 ] ermittelt werden. Die Read-Counts werden anschließend in geeignete Metriken für Hypothesentests, Regressionen und andere Analysen umgerechnet. Die Parameter für diese Umrechnung sind:

  • Sequenziertiefe/Abdeckung : Obwohl die Sequenziertiefe bei der Durchführung mehrerer RNA-Seq-Experimente vordefiniert ist, variiert sie dennoch stark zwischen den einzelnen Experimenten. [ 69 ] Daher wird die Gesamtzahl der in einem einzelnen Experiment generierten Reads typischerweise normalisiert, indem die Zählwerte in Fragmente, Reads oder Counts per Million mapped reads (FPM, RPM oder CPM) umgerechnet werden. Der Unterschied zwischen RPM und FPM entstand historisch bedingt durch die Entwicklung von der Single-End-Sequenzierung von Fragmenten zur Paired-End-Sequenzierung. Bei der Single-End-Sequenzierung gibt es nur einen Read pro Fragment ( d. h . RPM = FPM). Bei der Paired-End-Sequenzierung gibt es zwei Reads pro Fragment ( d. h . RPM = 2 × FPM). Die Sequenziertiefe wird manchmal auch als Bibliotheksgröße bezeichnet, d. h. die Anzahl der intermediären cDNA-Moleküle im Experiment.
  • Genlänge: Längere Gene weisen bei gleicher Transkriptexpression mehr Fragmente/Reads/Counts auf als kürzere. Dies wird korrigiert, indem der FPM-Wert durch die Länge eines Merkmals (Gen, Transkript oder Exon) dividiert wird. Das Ergebnis ist die Metrik Fragmente pro Kilobase Merkmal pro Million zugeordneter Reads (FPKM). [ 70 ] Bei der Betrachtung von Merkmalsgruppen über verschiedene Proben hinweg wird der FPKM-Wert in Transkripte pro Million (TPM) umgerechnet, indem jeder FPKM-Wert durch die Summe der FPKM-Werte innerhalb einer Probe dividiert wird. [ 71 ] [ 72 ] [ 73 ]
  • Gesamt-RNA-Ausbeute der Probe: Da aus jeder Probe die gleiche Menge RNA extrahiert wird, enthalten Proben mit mehr Gesamt-RNA weniger RNA pro Gen. Diese Gene scheinen eine verminderte Expression aufzuweisen, was zu falsch-positiven Ergebnissen in nachfolgenden Analysen führen kann. [ 69 ] Normalisierungsstrategien wie Quantil-, DESeq2-, TMM- und Median-Ratio-Normalisierung versuchen, diesen Unterschied auszugleichen, indem sie eine Gruppe nicht-differenziell exprimierter Gene zwischen den Proben vergleichen und die Ergebnisse entsprechend skalieren. [ 74 ]
  • Die Varianz der Genexpression wird modelliert, um Stichprobenfehler zu berücksichtigen(wichtig für Gene mit wenigen Messwerten), die statistische Aussagekraft zu erhöhen und falsch positive Ergebnisse zu reduzieren. Die Varianz kann als Normal- , Poisson- oder negative Binomialverteilung geschätzt werden [ 75 ] [ 76 ] [ 77 ] und wird häufig in technische und biologische Varianz unterteilt.

Spike-ins zur absoluten Quantifizierung und zum Nachweis genomweiter Effekte

RNA-Spike-ins sind RNA-Proben mit bekannter Konzentration, die als Goldstandards bei der Versuchsplanung und bei nachfolgenden Analysen zur absoluten Quantifizierung und zum Nachweis genomweiter Effekte verwendet werden können.

  • Absolute Quantifizierung: Eine absolute Quantifizierung der Genexpression ist mit den meisten RNA-Seq-Experimenten nicht möglich, da diese die Expression relativ zu allen Transkripten quantifizieren. Sie ist jedoch durch RNA-Seq mit Spike-ins , d. h. RNA-Proben bekannter Konzentrationen, möglich. Nach der Sequenzierung werden die Read-Counts der Spike-in-Sequenzen verwendet, um das Verhältnis zwischen den Read-Counts der einzelnen Gene und den absoluten Mengen biologischer Fragmente zu bestimmen. [ 17 ] [ 78 ] In einem Beispiel wurde diese Technik in Xenopus tropicalis -Embryonen eingesetzt, um die Transkriptionskinetik zu bestimmen. [ 79 ]
  • Nachweis genomweiter Effekte: Veränderungen globaler Regulatoren, einschließlich Chromatin-Remodellierer , Transkriptionsfaktoren (z. B. MYC ), Acetyltransferase- Komplexen und der Nukleosomenpositionierung, sind nicht mit Normalisierungsannahmen vereinbar, und Spike-in-Kontrollen können eine präzise Interpretation ermöglichen. [ 80 ] [ 81 ]

Anwendungen

Differenzielle Expression

Die einfachste, aber oft wirkungsvollste Anwendung von RNA-Seq ist die Identifizierung von Unterschieden in der Genexpression zwischen zwei oder mehr Bedingungen ( z. B. behandelt vs. unbehandelt). Dieser Prozess wird als differentielle Expression bezeichnet. Die Ergebnisse werden häufig als differentiell exprimierte Gene (DEGs) bezeichnet. Diese Gene können entweder hoch- oder herunterreguliert sein ( d. h . in der betrachteten Bedingung höher oder niedriger exprimiert). Es gibt zahlreiche Tools zur Durchführung der differentiellen Expressionsanalyse . Die meisten werden in R , Python oder über die Unix -Befehlszeile ausgeführt. Häufig verwendete Tools sind DESeq [ 76 ] , edgeR [ 77 ] und voom+limma [ 75 , 82 ], die alle über R/ Bioconductor verfügbar sind [ 83 , 84 ] . Folgende Aspekte sind bei der Durchführung der differentiellen Expressionsanalyse zu berücksichtigen:

  • Eingaben: Die Eingaben für die differentielle Genexpression umfassen (1) eine RNA-Seq-Expressionsmatrix (M Gene x N Proben) und (2) eine Designmatrix mit den experimentellen Bedingungen für N Proben. Die einfachste Designmatrix enthält eine Spalte, die den Labels für die getestete Bedingung entspricht. Weitere Kovariaten (auch Faktoren, Merkmale, Labels oder Parameter genannt) können Batch-Effekte , bekannte Artefakte und Metadaten umfassen, die die Genexpression beeinflussen oder modulieren könnten. Neben bekannten Kovariaten können unbekannte Kovariaten auch mithilfe unüberwachter maschineller Lernverfahren wie Hauptkomponentenanalyse , Surrogatvariablenanalyse [ 85 ] und PEER- Analyse [ 38 ] geschätzt werden . Analysen versteckter Variablen werden häufig für RNA-Seq-Daten von menschlichem Gewebe eingesetzt, da diese typischerweise zusätzliche Artefakte aufweisen, die nicht in den Metadaten erfasst sind ( z. B. Ischämiezeit, Daten aus mehreren Institutionen, zugrunde liegende klinische Merkmale, Datenerhebung über viele Jahre mit unterschiedlichem Personal).
  • Methoden: Die meisten Tools verwenden Regression oder nichtparametrische statistische Verfahren zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene. Sie basieren entweder auf Read-Counts, die auf ein Referenzgenom abgebildet wurden (DESeq2, limma, edgeR), oder auf Read-Counts, die aus einer alignierungsfreien Quantifizierung abgeleitet wurden (sleuth, [ 86 ] Cuffdiff, [ 87 ] Ballgown [ 88 ] ). [ 89 ] Im Anschluss an die Regression wenden die meisten Tools entweder eine Korrektur des Familywise Error Rate (FWER) oder des False Discovery Rate (FDR) für den p-Wert an, um multiple Hypothesen zu berücksichtigen (in Humanstudien ca. 20.000 proteinkodierende Gene oder ca. 50.000 Biotypen).
  • Ausgabe: Eine typische Ausgabe besteht aus Zeilen, die der Anzahl der Gene entsprechen, und mindestens drei Spalten: dem Log- Fold-Change ( logarithmierte Expressionsänderung zwischen den Bedingungen, ein Maß für die Effektstärke ), dem p-Wert und dem für Mehrfachvergleiche korrigierten p-Wert jedes Gens. Gene gelten als biologisch relevant, wenn sie bestimmte Schwellenwerte für Effektstärke (Log-Fold-Change) und statistische Signifikanz überschreiten . Diese Schwellenwerte sollten idealerweise a priori festgelegt werden . Da RNA-Seq-Experimente jedoch häufig explorativ angelegt sind, lassen sich Effektstärken und relevante Schwellenwerte nur schwer im Voraus vorhersagen.
  • Fallstricke: Der Sinn dieser komplexen Methoden liegt darin, die zahlreichen Fallstricke zu vermeiden, die zu statistischen Fehlern und irreführenden Interpretationen führen können. Zu diesen Fallstricken zählen erhöhte falsch-positive Raten (aufgrund multipler Vergleiche), Artefakte bei der Probenvorbereitung, Heterogenität der Proben (z. B. gemischte genetische Hintergründe), hochkorrelierte Proben, nicht berücksichtigte mehrstufige Versuchsdesigns und mangelhafte Versuchsplanung . Ein besonders wichtiger Fallstrick ist die Anzeige von Ergebnissen in Microsoft Excel ohne die Importfunktion, die sicherstellt, dass die Genbezeichnungen als Text erhalten bleiben. [ 90 ] Obwohl praktisch, wandelt Excel einige Genbezeichnungen ( SEPT1 , DEC1 , MARCH2 ) automatisch in Datumsangaben oder Gleitkommazahlen um.
  • Werkzeugauswahl und Benchmarking: Es gibt zahlreiche Studien, die die Ergebnisse dieser Werkzeuge vergleichen, wobei DESeq2 tendenziell etwas besser abschneidet als andere Methoden. [ 91 ] [ 92 ] [ 93 ] [ 94 ] [ 28 ] [ 89 ] [ 95 ] [ 96 ] Wie bei anderen Methoden besteht das Benchmarking darin, die Ergebnisse der Werkzeuge untereinander und mit bekannten Referenzwerten zu vergleichen .

Die nachfolgenden Analysen einer Liste differentiell exprimierter Gene lassen sich in zwei Kategorien einteilen: Validierung von Beobachtungen und Ableitung biologischer Schlussfolgerungen. Aufgrund der Fallstricke der differentiellen Genexpression und RNA-Seq werden wichtige Beobachtungen entweder (1) mit einer orthogonalen Methode an denselben Proben (z. B. Real-Time-PCR ) oder (2) in einem weiteren, gegebenenfalls vorab registrierten Experiment an einer neuen Kohorte repliziert. Letzteres trägt zur Sicherstellung der Generalisierbarkeit bei und kann typischerweise durch eine Metaanalyse aller gepoolten Kohorten ergänzt werden. Die gängigste Methode zur Gewinnung eines tieferen biologischen Verständnisses der Ergebnisse ist die Gen-Set-Anreicherung , wobei gelegentlich auch Kandidatengen-Ansätze zum Einsatz kommen. Die Gen-Set-Anreicherung ermittelt, ob die Überlappung zwischen zwei Gen-Sets statistisch signifikant ist, in diesem Fall die Überlappung zwischen differentiell exprimierten Genen und Gen-Sets aus bekannten Signalwegen/Datenbanken ( z. B. Gene Ontology , KEGG , Human Phenotype Ontology ) oder aus komplementären Analysen derselben Daten (z. B. Koexpressionsnetzwerke). Gängige Werkzeuge zur Gen-Set-Anreicherung umfassen Web-Schnittstellen ( z. B. ENRICHR, g:profiler, WEBGESTALT) [ 97 ] und Softwarepakete. Bei der Auswertung der Anreicherungsergebnisse empfiehlt es sich, zunächst die Anreicherung bekannter biologischer Prozesse zu überprüfen und anschließend den Suchbereich auf neue biologische Prozesse auszuweiten.

Beispiele für alternative RNA-Spleißmodi. Exons werden als blaue und gelbe Blöcke dargestellt, gespleißte Introns als horizontale schwarze Linien, die zwei Exons verbinden, und Exon-Exon-Verbindungen als dünne graue Verbindungslinien zwischen zwei Exons.

Alternatives Spleißen

RNA-Spleißen ist ein integraler Bestandteil von Eukaryoten und trägt wesentlich zur Proteinregulation und -diversität bei; es findet in über 90 % der menschlichen Gene statt. [ 98 ] Es gibt verschiedene alternative Spleißmodi : Exon-Skipping (häufigster Spleißmodus bei Menschen und höheren Eukaryoten), sich gegenseitig ausschließende Exons, alternative Donor- oder Akzeptorstellen, Intron-Retention (häufigster Spleißmodus bei Pflanzen, Pilzen und Protozoen), alternative Transkriptionsstartstellen (Promotoren) und alternative Polyadenylierung. [ 98 ] Ein Ziel der RNA-Sequenzierung ist die Identifizierung alternativer Spleißereignisse und die Untersuchung, ob sie sich unter verschiedenen Bedingungen unterscheiden. Die Langsequenzierung erfasst das vollständige Transkript und minimiert somit viele Probleme bei der Bestimmung der Isoformhäufigkeit, wie z. B. die Zuordnung mehrdeutiger Reads. Für die Kurzsequenzierung mittels RNA-Sequenzierung gibt es verschiedene Methoden zum Nachweis alternativen Spleißens, die in drei Hauptgruppen eingeteilt werden können: [ 99 ] [ 71 ] [ 100 ]

  • Zählbasierte (auch ereignisbasierte, differentielle Spleißen-) Methoden schätzen die Exon-Retention. Beispiele hierfür sind DEXSeq, [ 101 ] MATS, [ 102 ] und SeqGSEA. [ 103 ]
  • Isoformbasierte Verfahren (auch Multi-Read-Module, differentielle Isoformexpression) : Zuerst wird die Isoformhäufigkeit und anschließend die relative Häufigkeit zwischen den Bedingungen geschätzt. Beispiele hierfür sind Cufflinks 2 [ 104 ] und DiffSplice [ 105 ] .
  • Intron-Exzision-basiert: Berechnung alternativer Spleißvarianten mithilfe von Split-Reads. Beispiele hierfür sind MAJIQ [ 106 ] und Leafcutter [ 100 ] .

Werkzeuge zur differentiellen Genexpression können auch zur differentiellen Isoformexpression eingesetzt werden, wenn die Isoformen zuvor mit anderen Werkzeugen wie RSEM quantifiziert wurden. [ 107 ]

Koexpressionsnetzwerke

Koexpressionsnetzwerke sind datenbasierte Darstellungen von Genen, die sich in verschiedenen Geweben und unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ähnlich verhalten. [ 108 ] Ihr Hauptzweck liegt in der Hypothesengenerierung und in Assoziationsanalysen zur Ableitung von Funktionen bisher unbekannter Gene. [ 108 ] RNA-Seq-Daten wurden verwendet, um Gene, die an spezifischen Signalwegen beteiligt sind, anhand der Pearson-Korrelation sowohl in Pflanzen [ 109 ] als auch in Säugetieren [ 110 ] zu identifizieren . Der Hauptvorteil von RNA-Seq-Daten gegenüber Microarray-Plattformen bei dieser Art der Analyse ist die Möglichkeit, das gesamte Transkriptom abzudecken und somit umfassendere Darstellungen der Genregulationsnetzwerke zu erhalten. Die differentielle Regulation von Spleißvarianten desselben Gens kann detektiert und zur Vorhersage ihrer biologischen Funktionen genutzt werden. [ 111 ] [ 112 ] Die gewichtete Gen-Koexpressionsnetzwerkanalyse wurde erfolgreich zur Identifizierung von Koexpressionsmodulen und intramodularen Hub-Genen auf Basis von RNA-Seq-Daten eingesetzt. Koexpressionsmodule können Zelltypen oder Signalwegen entsprechen. Hochvernetzte intramodulare Hubs können als Repräsentanten ihres jeweiligen Moduls interpretiert werden. Ein Eigengen ist die gewichtete Summe der Expression aller Gene eines Moduls. Eigengene sind nützliche Biomarker (Merkmale) für Diagnose und Prognose. [ 113 ] Es wurden Varianzstabilisierende Transformationsverfahren zur Schätzung von Korrelationskoeffizienten auf Basis von RNA-Seq-Daten vorgeschlagen. [ 109 ]

Variantenentdeckung

RNA-Seq erfasst DNA-Variationen, darunter Einzelnukleotidvarianten , kleine Insertionen/Deletionen und Strukturvarianten . Die Variantenidentifizierung in RNA-Seq ähnelt der DNA-Variantenidentifizierung und verwendet häufig dieselben Tools (wie SAMtools mpileup [ 114 ] und GATK HaplotypeCaller [ 115 ] ), wobei Anpassungen zur Berücksichtigung des Spleißens vorgenommen werden. Eine Besonderheit von RNA-Varianten ist die allelspezifische Expression (ASE) : Varianten eines bestimmten Haplotyps können aufgrund regulatorischer Effekte wie Imprinting , Expressions-QTLs und nicht-kodierender seltener Varianten bevorzugt exprimiert werden . [ 116 ] [ 117 ] Zu den Einschränkungen der RNA-Variantenidentifizierung gehört, dass sie nur exprimierte Regionen widerspiegelt (beim Menschen <5 % des Genoms), Verzerrungen durch die Datenverarbeitung unterliegen kann (z. B. unterschätzen De-novo-Transkriptom-Assemblierungen die Heterozygotie [ 118 ] ) und eine geringere Qualität im Vergleich zur direkten DNA-Sequenzierung aufweist.

RNA-Editierung (posttranskriptionelle Veränderungen)

Die Übereinstimmung der genomischen und transkriptomischen Sequenzen eines Individuums kann helfen, posttranskriptionelle Veränderungen ( RNA-Editierung ) zu erkennen. [ 3 ] Eine posttranskriptionelle Modifikation wird identifiziert, wenn das Transkript des Gens ein Allel/eine Variante aufweist, die in den genomischen Daten nicht beobachtet wurde.

Ein Genfusionsereignis und das Verhalten von gepaarten Sequenzabschnitten, die auf beiden Seiten der Genfusionsstelle liegen. Genfusionen können in trans , zwischen Genen auf verschiedenen Chromosomen, oder in cis , zwischen zwei Genen auf demselben Chromosom, auftreten.

Nachweis von Fusionsgenen

Fusionsgene, die durch verschiedene strukturelle Veränderungen im Genom entstehen, haben aufgrund ihres Zusammenhangs mit Krebs an Bedeutung gewonnen. [ 119 ] Die Fähigkeit der RNA-Sequenzierung, das gesamte Transkriptom einer Probe unvoreingenommen zu analysieren, macht sie zu einem attraktiven Werkzeug, um diese Art von häufigen Ereignissen bei Krebs zu identifizieren. [ 4 ]

Die Idee basiert auf dem Prozess der Ausrichtung kurzer Transkriptomsequenzen an einem Referenzgenom. Die meisten dieser Sequenzen liegen innerhalb eines vollständigen Exons, und ein kleinerer, aber dennoch großer Anteil dürfte bekannten Exon-Exon-Übergängen zugeordnet werden. Die verbleibenden, nicht zugeordneten Sequenzen werden anschließend weiter analysiert, um festzustellen, ob sie mit einem Exon-Exon-Übergang übereinstimmen, bei dem die Exons aus verschiedenen Genen stammen. Dies wäre ein Hinweis auf ein mögliches Fusionsereignis. Aufgrund der Länge der Sequenzen kann dieses Ergebnis jedoch sehr verrauscht sein. Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung von Paired-End-Sequenzen. Hierbei kann eine potenziell große Anzahl gepaarter Sequenzen jedes Ende einem anderen Exon zuordnen, was eine bessere Abdeckung dieser Ereignisse ermöglicht (siehe Abbildung). Das Endergebnis besteht letztendlich aus mehreren und potenziell neuen Genkombinationen und bietet somit einen idealen Ausgangspunkt für die weitere Validierung.

Kopienzahlanalysen

Kopienzahl-Analysen (CNA) werden häufig in der Krebsforschung eingesetzt. Genverluste und -gewinne haben Auswirkungen auf Signalwege und sind ein wichtiger Biomarker für molekulare Dysfunktionen in der Onkologie. Die Bestimmung von CNA-Informationen aus RNA-Seq-Daten ist aufgrund der Unterschiede in der Genexpression, die zu unterschiedlich starken Schwankungen der Lesetiefe zwischen den Genen führen, nicht trivial. Aus diesem Grund werden die meisten dieser Analysen üblicherweise mittels Ganzgenomsequenzierung (WGS) bzw. Ganzexomsequenzierung (WES) durchgeführt. Moderne Bioinformatik-Tools können jedoch CNA-Informationen auch aus RNA-Seq-Daten gewinnen. [ 9 ]

Biomarker-Entdeckung

RNA-Seq birgt das Potenzial, neue Krankheitsbiologie zu identifizieren, Biomarker für klinische Indikationen zu profilieren, therapeutisch nutzbare Signalwege abzuleiten und genetische Diagnosen zu stellen. [ 120 ] [ 121 ] Diese Ergebnisse könnten für Subgruppen oder sogar einzelne Patienten weiter personalisiert werden und so potenziell effektivere Prävention, Diagnostik und Therapie ermöglichen. Die Machbarkeit dieses Ansatzes wird zum Teil durch den Kosten- und Zeitaufwand bestimmt; eine damit verbundene Einschränkung ist das erforderliche Team von Spezialisten (Bioinformatiker, Ärzte/Kliniker, Grundlagenforscher, Techniker), um die enorme Datenmenge, die durch diese Analyse generiert wird, vollständig zu interpretieren. [ 122 ]

Multiomics

RNA-Seq-Daten haben große Bedeutung erlangt, nachdem die Projekte „ Encyclopedia of DNA Elements“ (ENCODE) und „The Cancer Genome Atlas “ (TCGA) diesen Ansatz zur Charakterisierung von Dutzenden Zelllinien [ 123 ] bzw. Tausenden von Primärtumorproben [ 124 ] genutzt haben . ENCODE zielte darauf ab, genomweite regulatorische Regionen in verschiedenen Zelllinienkohorten zu identifizieren. Transkriptomdaten sind dabei unerlässlich, um die nachgelagerten Effekte dieser epigenetischen und genetischen Regulationsebenen zu verstehen. TCGA hingegen hatte zum Ziel, Tausende von Patientenproben aus 30 verschiedenen Tumorarten zu sammeln und zu analysieren, um die zugrundeliegenden Mechanismen der malignen Transformation und Progression zu erforschen. In diesem Kontext liefern RNA-Seq-Daten eine einzigartige Momentaufnahme des transkriptomischen Status der Erkrankung und ermöglichen durch die Betrachtung einer unvoreingenommenen Population von Transkripten die Identifizierung neuartiger Transkripte, Fusions-Transkripte und nicht-kodierender RNAs, die mit anderen Technologien möglicherweise unentdeckt blieben.

Weitere neue Analyse- und Anwendungsmöglichkeiten

Die Anwendungsgebiete von RNA-Seq nehmen stetig zu. Weitere neue Anwendungen von RNA-Seq umfassen den Nachweis mikrobieller Kontaminanten [ 125 ] , die Bestimmung der Zelltyphäufigkeit (Zelltyp-Dekonvolution) [ 9 ] , die Messung der Expression von Transposons und die Neoantigen-Vorhersage usw. [ 9 ].

Siehe auch

Referenzen

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Weiterführende Literatur

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