Konfokale mikroskopische Aufnahme einer Kolonie humaner induzierter pluripotenter Stammzellen, die von einem Patienten mit okulokutanem Albinismus stammen . Rot kennzeichnet den Transkriptionsfaktor Oct-4 , grün das Protein SSEA4 und blau die Zellkerne .
Kolonien menschlicher iPS-Zellen. Die spindelförmigen Zellen im Hintergrund sind Mausfibroblasten. Nur die Zellen der zentralen Kolonie sind menschliche iPS-Zellen.

Induzierte pluripotente Stammzellen (auch iPS- Zellen oder iPSCs genannt ) sind eine Art pluripotenter Stammzellen , die direkt aus somatischen Zellen gewonnen werden können . Die iPSC-Technologie wurde von Shinya Yamanaka und Kazutoshi Takahashi in Kyoto , Japan , entwickelt. Sie zeigten 2006 gemeinsam, dass die Einführung von vier spezifischen Genen ( c-Myc , Oct4 , Sox2 und KLF4 ), den sogenannten Yamanaka-Faktoren, die für Transkriptionsfaktoren kodieren , somatische Zellen in pluripotente Stammzellen umwandeln kann. [ 1 ] Shinya Yamanaka erhielt 2012 zusammen mit Sir John Gurdon den Nobelpreis „für die Entdeckung, dass reife Zellen zu pluripotenten Zellen reprogrammiert werden können“. [ 2 ]

Pluripotente Stammzellen bergen großes Potenzial im Bereich der regenerativen Medizin . [ 3 ] Da sie sich unbegrenzt vermehren und zu jedem anderen Zelltyp im Körper (wie Neuronen, Herz-, Pankreas- und Leberzellen) differenzieren können, stellen sie eine einzige Zellquelle dar, die zum Ersatz von durch Schäden oder Krankheiten verloren gegangenen Zellen genutzt werden könnte.

Die bekannteste Art pluripotenter Stammzellen sind embryonale Stammzellen . Da die Gewinnung embryonaler Stammzellen jedoch die Zerstörung (oder zumindest Manipulation) [ 4 ] eines Embryos im Präimplantationsstadium beinhaltet, ist ihre Verwendung umstritten . Mithilfe des somatischen Zellkerntransfers (SCNT) können nun patientenspezifische embryonale Stammzelllinien gewonnen werden .

Da iPS-Zellen direkt aus adultem Gewebe gewonnen werden können, entfällt nicht nur die Notwendigkeit von Embryonen, sondern sie können auch patientenspezifisch hergestellt werden. Das bedeutet, dass jeder Mensch seine eigene pluripotente Stammzelllinie besitzen könnte. Diese unbegrenzte Menge an autologen Zellen könnte zur Erzeugung von Transplantaten ohne das Risiko einer Immunreaktion genutzt werden. Obwohl die iPS-Zelltechnologie noch nicht so weit fortgeschritten ist, dass therapeutische Transplantationen als sicher gelten, werden iPS-Zellen bereits intensiv in der personalisierten Arzneimittelforschung und zum Verständnis der patientenspezifischen Krankheitsursachen eingesetzt. [ 5 ]

Yamanaka nannte die iPSCs mit kleinem „i“, da der iPod und andere Apple- Produkte sehr beliebt waren. [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]

In seinem Nobelpreisseminar zitierte Yamanaka die frühere bahnbrechende Arbeit von Harold Weintraub über die Rolle des Myoblasten-Determinationsproteins 1 (MyoD) bei der Umprogrammierung des Zellschicksals hin zu einer Muskelzelllinie als wichtigen Vorläufer der Entdeckung von iPS-Zellen. [ 10 ]

Produktion

Schema zur Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS-Zellen). (1) Spenderzellen isolieren und kultivieren. (2) Stammzellassoziierte Gene mittels viraler Vektoren in die Zellen transduzieren. Rote Zellen kennzeichnen die Zellen, die die exogenen Gene exprimieren. (3) Die Zellen ernten und analog zur ES- Zellkultur unter Verwendung mitotisch inaktivierter Feederzellen (hellgrau) kultivieren. (4) Ein kleiner Teil der transfizierten Zellen differenziert sich zu iPS-Zellen und bildet ES-ähnliche Kolonien.

iPS-Zellen werden typischerweise durch die Einführung von Produkten spezifischer Gruppen pluripotenzassoziierter Gene, sogenannter „Reprogrammierungsfaktoren“, in einen bestimmten Zelltyp erzeugt. Die ursprünglichen Reprogrammierungsfaktoren (auch Yamanaka-Faktoren genannt) sind die Transkriptionsfaktoren Oct4 (Pou5f1), Sox2 , Klf4 und cMyc . Obwohl diese Kombination am häufigsten zur Herstellung von iPS-Zellen verwendet wird, kann jeder dieser Faktoren funktionell durch verwandte Transkriptionsfaktoren, miRNAs , niedermolekulare Substanzen oder sogar nicht verwandte Gene wie Linien-Spezifizierer ersetzt werden. [ 11 ] Es ist außerdem bekannt, dass pro-mitotische Faktoren wie C-MYC/L-MYC oder die Repression von Zellzyklus- Kontrollpunkten wie p53 dazu beitragen, einen geeigneten Zellzustand für die iPS-Zell-Reprogrammierung zu schaffen. [ 12 ]

Die Gewinnung von iPS-Zellen ist typischerweise ein langsamer und ineffizienter Prozess, der bei Mauszellen ein bis zwei Wochen und bei menschlichen Zellen drei bis vier Wochen dauert, mit einer Effizienz von etwa 0,01–0,1 %. Es wurden jedoch erhebliche Fortschritte bei der Verbesserung der Effizienz und der benötigten Zeit zur Gewinnung von iPS-Zellen erzielt. Nach Zugabe von Reprogrammierungsfaktoren beginnen die Zellen, Kolonien zu bilden, die pluripotenten Stammzellen ähneln. Diese können anhand ihrer Morphologie, Selektionsbedingungen für ihr Wachstum oder durch die Expression von Oberflächenmarkern oder Reportergenen isoliert werden .

Erste Generation (Maus)

Induzierte pluripotente Stammzellen wurden erstmals 2006 von Shinya Yamanaka und Kazutoshi Takahashi an der Universität Kyoto , Japan, erzeugt. [ 1 ] Sie stellten die Hypothese auf, dass Gene, die für die Funktion embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) wichtig sind, einen embryonalen Zustand in adulten Zellen induzieren könnten. Sie wählten 24 Gene aus, die zuvor als wichtig für ES-Zellen identifiziert worden waren, und nutzten Retroviren, um diese Gene in Mausfibroblasten einzuschleusen . Die Fibroblasten wurden so verändert, dass Zellen, die das ES-Zell-spezifische Gen Fbx15 reaktivierten , mittels Antibiotika-Selektion isoliert werden konnten.

Nach Zugabe aller 24 Faktoren entstanden ESC-ähnliche Kolonien, die den Fbx15-Reporter reaktivierten und sich unbegrenzt vermehren konnten. Um die für die Reprogrammierung notwendigen Gene zu identifizieren, entfernten die Forscher jeweils einen Faktor aus dem Pool der 24. Dadurch identifizierten sie vier Faktoren – Oct4, Sox2, cMyc und Klf4 –, die jeweils einzeln notwendig und zusammen ausreichend waren, um unter Selektion auf die Reaktivierung von Fbx15 ESC-ähnliche Kolonien zu erzeugen.

Zweite Generation (Maus)

Im Juni 2007 veröffentlichten drei unabhängige Forschungsgruppen, darunter die von Yamanaka, eine Kooperation zwischen Harvard und der University of California, Los Angeles , sowie eine Gruppe am MIT , Studien, die den Reprogrammierungsansatz deutlich verbesserten und zu iPS-Zellen führten, die von ESCs nicht zu unterscheiden waren. Im Gegensatz zur ersten Generation von iPS-Zellen erzeugten diese iPS-Zellen der zweiten Generation lebensfähige chimäre Mäuse und trugen zur Keimbahn der Maus bei, wodurch der Goldstandard für pluripotente Stammzellen erreicht wurde.

Diese iPS-Zellen der zweiten Generation wurden aus Mausfibroblasten durch retrovirale Expression derselben vier Transkriptionsfaktoren (Oct4, Sox2, cMyc, Klf4) gewonnen. Anstatt jedoch Fbx15 zur Selektion pluripotenter Zellen zu verwenden, nutzten die Forscher Nanog , ein Gen, das für embryonale Stammzellen (ES-Zellen) funktionell wichtig ist. Mit dieser anderen Strategie erzeugten die Forscher iPS-Zellen, die funktionell mit ES-Zellen identisch waren. [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]

Menschliche induzierte pluripotente Stammzellen

Erzeugung aus menschlichen Fibroblasten

Die Reprogrammierung menschlicher Zellen zu iPS-Zellen wurde im November 2007 von zwei unabhängigen Forschungsgruppen berichtet: Shinya Yamanaka von der Universität Kyoto, Japan, der die ursprüngliche iPS-Zell-Methode entwickelte, und James Thomson von der Universität Wisconsin-Madison, dem es als erstem gelang, humane embryonale Stammzellen zu gewinnen. Mit dem gleichen Prinzip wie bei der Reprogrammierung von Mäusen transformierte Yamanakas Gruppe mithilfe eines retroviralen Systems erfolgreich menschliche Fibroblasten in iPS-Zellen mit denselben vier Schlüsselgenen Oct4, Sox2, Klf4 und cMyc [ 17 ] . Thomson und Kollegen hingegen verwendeten ein anderes Genset mit den Faktoren Oct4, Sox2, Nanog und Lin28 mithilfe eines lentiviralen Systems [ 18 ] .

Erzeugung aus zusätzlichen Zelltypen

Die Gewinnung von Fibroblasten zur Herstellung von iPS-Zellen erfordert eine Hautbiopsie . Daher wird verstärkt nach leichter zugänglichen Zelltypen gesucht. [ 19 ] [ 20 ] Im Jahr 2008 wurden iPS-Zellen aus humanen Keratinozyten gewonnen, die aus einem einzelnen Haar gewonnen werden konnten. [ 21 ] [ 22 ] Im Jahr 2010 gelang die Gewinnung von iPS-Zellen aus peripheren Blutzellen [ 23 ] [ 24 ] und im Jahr 2012 die Herstellung von iPS-Zellen aus Nierenepithelzellen im Urin. [ 25 ]

Weitere Kriterien für die Wahl des Ausgangszelltyps sind die Mutationslast (beispielsweise können Hautzellen aufgrund von UV-Strahlung mehr Mutationen aufweisen) [ 19 ] [ 20 ] , die Zeit, die zur Vermehrung der Ausgangszellpopulation benötigt wird [ 19 ] , und die Fähigkeit zur Differenzierung in einen bestimmten Zelltyp. [ 26 ]

Gene, die zur Herstellung von iPS-Zellen verwendet werden

Die Erzeugung induzierter pluripotenter Zellen hängt entscheidend von den für die Induktion verwendeten Transkriptionsfaktoren ab.

Oct-3/4 und bestimmte Produkte der Sox-Genfamilie (Sox1, Sox2, Sox3 und Sox15) wurden als entscheidende Transkriptionsregulatoren identifiziert, die am Induktionsprozess beteiligt sind und deren Fehlen eine Induktion unmöglich macht. Weitere Gene, darunter bestimmte Mitglieder der Klf-Familie (Klf1, Klf2, Klf4 und Klf5), der Myc-Familie (c-myc, L-myc und N-myc), Nanog und LIN28 , erhöhen hingegen die Induktionseffizienz. [ 27 ]

  • Oct-3/4 (Pou5f1) gehört zur Familie der Octamer-Transkriptionsfaktoren („Oct“) und spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz. Das Fehlen von Oct-3/4 in Oct-3/4 + -Zellen, wie Blastomere und embryonale Stammzellen, führt zur spontanen Trophoblastendifferenzierung . Die Anwesenheit von Oct-3/4 verleiht embryonalen Stammzellen somit Pluripotenz und Differenzierungspotenzial. Verschiedene andere Gene der „Oct“-Familie, darunter die nahen Verwandten von Oct-3/4, Oct1 und Oct6 , induzieren keine Expression, was die Exklusivität von Oct-3/4 für den Induktionsprozess belegt. Schöler zeigte, dass die Überexpression von Oct4 während der Reprogrammierung epigenetische Veränderungen verursacht, die die Qualität von iPS-Zellen beeinträchtigen. Im Vergleich zu OSKM (Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc) erzeugt die Reprogrammierung von neuem SKM (Sox2, Klf4 und c-Myc) iPS-Zellen mit einem Entwicklungspotenzial, das dem embryonaler Stammzellen entspricht, wie durch ihre Fähigkeit zur Erzeugung von All-iPSC-Mäusen mittels tetraploider Embryonenkomplementation gezeigt wurde . [ 28 ] [ 29 ] iPS-Zellen mit höherem Entwicklungspotenzial könnten auch durch die Steigerung der Dimerisierung zwischen Oct4 und Sox2 mithilfe eines chimären Sox-Faktors generiert werden. [ 30 ]
  • Sox-Familie : Die Sox-Familie der Transkriptionsfaktoren ist ähnlich wie Oct-3/4 an der Aufrechterhaltung der Pluripotenz beteiligt, jedoch im Gegensatz zu Oct-3/4, das ausschließlich in pluripotenten Stammzellen exprimiert wird, sowohl mit multipotenten als auch mit unipotenten Stammzellen assoziiert. Während Sox2 das erste Gen war, das von Yamanaka et al., Jaenisch et al. und Thomson et al. zur Induktion verwendet wurde, haben sich andere Transkriptionsfaktoren der Sox-Familie als ebenso wirksam erwiesen. Sox1 erzeugt iPS-Zellen mit ähnlicher Effizienz wie Sox2, und die Gene Sox3 , Sox15 und Sox18 generieren ebenfalls iPS-Zellen, wenn auch mit geringerer Effizienz. Velychko et al. entwickelten einen chimären Super-Reprogrammierungsfaktor, Sox2-17 oder „Super-Sox“, der die Generierung von Maus-, Human-, Javaneraffen-, Schweine- und Rinder-iPS-Zellen verbesserte oder ermöglichte. [ 30 ]
  • Klf-Familie : Klf4, ein Transkriptionsfaktor der Klf-Familie, wurde ursprünglich von Yamanaka et al. identifiziert und von Jaenisch et al. als Faktor für die Generierung von Maus-iPS-Zellen bestätigt. Yamanaka et al. zeigten zudem, dass Klf4 auch für die Generierung humaner iPS-Zellen geeignet ist. Thomson et al. berichteten jedoch, dass Klf4 für die Generierung humaner iPS-Zellen nicht notwendig sei und tatsächlich keine humanen iPS-Zellen generieren könne. Klf2 und Klf4 erwiesen sich hingegen als Faktoren, die iPS-Zellen generieren können, ebenso wie die verwandten Gene Klf1 und Klf5 , wenn auch mit reduzierter Effizienz.
  • Myc-Familie : Die Myc-Familie der Transkriptionsfaktoren umfasst Proto-Onkogene, die mit Krebs in Verbindung gebracht werden. Yamanaka et al. und Jaenisch et al. zeigten, dass c-myc an der Generierung von Maus-iPS-Zellen beteiligt ist, und Yamanaka et al. wiesen nach, dass es auch bei der Generierung von humanen iPS-Zellen eine Rolle spielt. Allerdings ist die Verwendung der „myc“-Genfamilie zur Induktion von iPS-Zellen laut Thomson et al. und Yamanaka et al. problematisch für die zukünftige klinische Anwendung von iPS-Zellen, da 25 % der Mäuse, denen c-myc-induzierte iPS-Zellen transplantiert wurden, letale Teratome entwickelten . N-myc und L-myc wurden als Alternativen zu c-myc mit ähnlicher Effizienz identifiziert.
  • Nanog : In embryonalen Stammzellen ist Nanog zusammen mit Oct-3/4 und Sox2 für die Förderung der Pluripotenz notwendig. Daher war es überraschend, als Yamanaka et al. berichteten, dass Nanog für die Induktion nicht erforderlich sei, obwohl Thomson et al. die Generierung von iPS-Zellen mit Nanog als einem der Faktoren beschrieben hatten.
  • LIN28 : LIN28 ist ein mRNA-bindendes Protein [ 31 ] , das in embryonalen Stammzellen und embryonalen Karzinomzellen exprimiert wird und mit Differenzierung und Proliferation assoziiert ist. Thomson et al. zeigten, dass LIN28 in Kombination mit Oct4, Sox2 und Nanog ein Faktor bei der iPSC-Generierung ist. [ 18 ]
  • Glis1 : Glis1 ist ein Transkriptionsfaktor, der zusammen mit Oct-3/4, Sox2 und Klf4 zur Induktion von Pluripotenz eingesetzt werden kann. Im Vergleich zu C-myc bietet er zahlreiche Vorteile. [ 32 ]

Herausforderungen bei der Reprogrammierung von Zellen zur Pluripotenz

Obwohl die von Yamanaka und anderen entwickelten Methoden gezeigt haben, dass adulte Zellen in iPS-Zellen umprogrammiert werden können, bestehen mit dieser Technologie immer noch Herausforderungen:

  1. Geringe Effizienz: Die Umwandlung in iPS-Zellen war bisher extrem niedrig. So lag die Reprogrammierungsrate somatischer Zellen in iPS-Zellen in Yamanakas ursprünglicher Mausstudie beispielsweise bei 0,01–0,1 %. [ 1 ] Diese geringe Effizienz könnte auf den Bedarf an präzisem Timing, Balance und exakter Expression der Reprogrammierungsgene zurückzuführen sein. Sie könnte auch auf die Notwendigkeit seltener genetischer oder epigenetischer Veränderungen in der ursprünglichen somatischen Zellpopulation oder in der Langzeitkultur hindeuten. Kürzlich wurde jedoch ein Weg für eine effiziente Reprogrammierung gefunden, der die Herunterregulierung des NuRD -Komplexes ( Nucleosome Remodeling and Deacetylation ) erfordert. Die Überexpression von Mbd3, einer Untereinheit von NuRD, hemmt die Induktion von iPS-Zellen. Die Depletion von Mbd3 hingegen verbessert die Reprogrammierungseffizienz [ 33 ] , was zu einer deterministischen und synchronisierten iPS-Zell-Reprogrammierung führt (nahezu 100 % Effizienz innerhalb von sieben Tagen aus Maus- und menschlichen Zellen). [ 34 ]
  2. Genomische Insertion: Die genomische Integration der Transkriptionsfaktoren schränkt die Anwendbarkeit des Transkriptionsfaktoransatzes aufgrund des Risikos der Insertion von Mutationen in das Genom der Zielzelle ein. [ 35 ] Eine gängige Strategie zur Vermeidung genomischer Insertion ist die Verwendung eines anderen Vektors für die Genübertragung. Plasmide , Adenoviren und Transposonvektoren wurden untersucht, gehen jedoch häufig mit einem geringeren Durchsatz einher. [ 36 ] [ 37 ] [ 38 ]
  3. Tumorigenität: Je nach Methode birgt die Reprogrammierung adulter Zellen zur Gewinnung iPS-Zellen erhebliche Risiken, die deren Anwendung beim Menschen einschränken können. Beispielsweise kann die Verwendung von Viren zur genomischen Veränderung der Zellen die Expression von Onkogenen (krebsauslösenden Genen) auslösen. Im Februar 2008 verkündeten Wissenschaftler die Entdeckung einer Technik, mit der Onkogene nach der Induktion von Pluripotenz entfernt werden können, wodurch sich das Anwendungspotenzial von iPS-Zellen bei menschlichen Erkrankungen erhöht. [ 39 ] In einer anderen Studie berichtete Yamanaka, dass iPS-Zellen ohne das Onkogen c-Myc erzeugt werden können. Dieser Prozess war zwar langsamer und weniger effizient, die resultierenden Chimären entwickelten jedoch keinen Krebs. [ 40 ] Die Inaktivierung oder Deletion des Tumorsuppressors p53, eines Schlüsselregulators von Krebs, erhöht die Reprogrammierungseffizienz signifikant. [ 41 ] Es scheint also einen Zielkonflikt zwischen Reprogrammierungseffizienz und Tumorentstehung zu geben.
  4. Unvollständige Reprogrammierung: Die Reprogrammierung steht auch vor der Herausforderung der Vollständigkeit. Dies ist besonders schwierig, da der genomweite epigenetische Code an den des Zielzelltyps angepasst werden muss, um eine Zelle vollständig zu reprogrammieren. Drei unabhängige Forschungsgruppen konnten jedoch aus embryonalen Mausfibroblasten (MEF) gewonnene iPS-Zellen identifizieren, die in tetraploide Blastozysten injiziert werden konnten und zur Lebendgeburt von Mäusen führten, die vollständig von iPS-Zellen abstammten. Damit wurde die Debatte über die Gleichwertigkeit embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) und iPS-Zellen hinsichtlich ihrer Pluripotenz beendet. [ 42 ]
Diese Zeitleiste fasst die wichtigsten Strategien und Techniken zur Entwicklung von iPS-Zellen in den ersten fünf Jahren nach dem Durchbruch von Yamanaka et al. im Jahr 2006 zusammen. Zeilen mit ähnlichen Farben repräsentieren Studien, die ähnliche Strategien zur Reprogrammierung verwendeten.

Die Tabelle rechts fasst die wichtigsten Strategien und Techniken zur Entwicklung von iPS-Zellen in den ersten fünf Jahren nach dem Durchbruch von Yamanaka et al. im Jahr 2006 zusammen. Zeilen mit ähnlichen Farben repräsentieren Studien, die ähnliche Reprogrammierungsstrategien anwandten.

Alternative Ansätze

Nachahmung von Transkriptionsfaktoren mit Chemikalien

Eine der wichtigsten Strategien zur Vermeidung der Probleme (1) und (2) besteht in der Verwendung von niedermolekularen Substanzen , die die Wirkung von Transkriptionsfaktoren nachahmen können. Diese Verbindungen können einen Reprogrammierungsfaktor kompensieren, der das Genom nicht effektiv adressiert oder aus anderen Gründen nicht reprogrammiert; dadurch erhöhen sie die Reprogrammierungseffizienz. Sie vermeiden außerdem das Problem der genomischen Integration, die in manchen Fällen zur Tumorentstehung beiträgt. Wichtige Studien mit dieser Strategie wurden 2008 durchgeführt. Melton et al. untersuchten die Wirkung des Histon-Deacetylase- (HDAC)-Inhibitors Valproinsäure . Sie stellten fest, dass dieser die Reprogrammierungseffizienz um das 100-Fache steigerte (verglichen mit Yamanakas traditioneller Transkriptionsfaktormethode). [ 43 ] Die Forscher vermuteten, dass diese Verbindung die Signalgebung nachahmt, die üblicherweise durch den Transkriptionsfaktor c-Myc ausgelöst wird. Ein ähnlicher Kompensationsmechanismus wurde vorgeschlagen, um die Wirkung von Sox2 nachzuahmen . Im Jahr 2008 untersuchten Ding et al. Die Hemmung der Histonmethyltransferase (HMT) mit BIX-01294 in Kombination mit der Aktivierung von Calciumkanälen in der Plasmamembran wurde eingesetzt , um die Reprogrammierungseffizienz zu steigern. [ 44 ] Deng et al. von der Universität Peking berichteten im Juli 2013, dass induzierte pluripotente Stammzellen ohne genetische Modifikation erzeugt werden können. Sie verwendeten einen Cocktail aus sieben niedermolekularen Verbindungen, darunter DZNep, um somatische Zellen der Maus in Stammzellen zu differenzieren, die sie CiPS-Zellen nannten. Die Effizienz lag bei 0,2 % und war damit vergleichbar mit der von Standardverfahren zur iPSC-Produktion. Die CiPS-Zellen wurden in sich entwickelnde Mausembryonen eingebracht und trugen zu allen wichtigen Zelltypen bei, was ihre Pluripotenz belegte. [ 45 ] [ 46 ]

Ding et al . demonstrierten eine Alternative zur Reprogrammierung von Transkriptionsfaktoren durch den Einsatz von arzneimittelähnlichen Substanzen. Durch die Untersuchung des mesenchymalen-epithelialen Übergangs (MET), bei dem Fibroblasten in einen stammzellähnlichen Zustand überführt werden, identifizierte Dings Arbeitsgruppe zwei Substanzen – den ALK5- Inhibitor SB431412 und den MEK-Inhibitor ( Mitogen-aktivierte Proteinkinase ) PD0325901 –, die die Effizienz der klassischen genetischen Methode um das 100-Fache steigerten. Die Zugabe einer dritten Substanz, Thiazovivin , die bekanntermaßen am Zellüberlebensweg beteiligt ist, erhöhte die Effizienz um das 200-Fache. Die Kombination dieser drei Substanzen verkürzte zudem die Reprogrammierungsdauer der humanen Fibroblasten von vier auf zwei Wochen. [ 47 ] [ 48 ]

Im April 2009 wurde gezeigt, dass die Erzeugung von iPS-Zellen ohne genetische Veränderung der adulten Zelle möglich ist: Eine wiederholte Behandlung der Zellen mit bestimmten Proteinen, die über Polyarginin-Anker in die Zellen eingeschleust wurden, reichte aus, um Pluripotenz zu induzieren. [ 49 ] Die Abkürzung für diese iPS-Zellen lautet piPS-Zellen (proteininduzierte pluripotente Stammzellen).

Alternative Vektoren

Eine weitere wichtige Strategie zur Vermeidung von Problemen wie Tumorgenese und geringem Durchsatz besteht in der Verwendung alternativer Vektorformen: Adenoviren , Plasmide und nackte DNA- oder Proteinverbindungen.

Im Jahr 2008 nutzten Hochedlinger et al. ein Adenovirus, um die vier benötigten Transkriptionsfaktoren in die DNA von Haut- und Leberzellen von Mäusen einzuschleusen. Die so entstandenen Zellen waren mit embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) identisch. Das Adenovirus unterscheidet sich von anderen Vektoren wie Viren und Retroviren dadurch, dass es keine eigenen Gene in die Zielzelle einbringt und somit das Risiko einer Insertionsmutagenese vermeidet . [ 44 ] Im Jahr 2009 demonstrierten Freed et al. die erfolgreiche Reprogrammierung humaner Fibroblasten zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen). [ 50 ] Ein weiterer Vorteil von Adenoviren besteht darin, dass sie nur kurzzeitig vorhanden sein müssen, um eine effektive Reprogrammierung zu ermöglichen.

Ebenfalls im Jahr 2008 entdeckten Yamanaka et al., dass sie die vier notwendigen Gene mithilfe eines Plasmids übertragen konnten. [ 36 ] Die Arbeitsgruppe um Yamanaka reprogrammierte erfolgreich Mauszellen durch Transfektion mit zwei Plasmidkonstrukten, die die Reprogrammierungsfaktoren trugen; das erste Plasmid exprimierte c-Myc, das zweite die drei anderen Faktoren ( Oct4 , Klf4 und Sox2 ). Obwohl die Plasmidmethoden Viren vermeiden, benötigen sie dennoch krebsfördernde Gene für die Reprogrammierung. Ein weiteres Hauptproblem dieser Methoden ist ihre deutlich geringere Effizienz im Vergleich zu retroviralen Methoden. Darüber hinaus integrieren sich transfizierte Plasmide nachweislich in das Wirtsgenom und bergen daher weiterhin das Risiko der Insertionsmutagenese. Aufgrund der geringen Effizienz nicht-retroviraler Ansätze wurde versucht, die Technik mit dem sogenannten PiggyBac-Transposon-System zu verbessern . Mehrere Studien haben gezeigt, dass dieses System die wichtigsten Reprogrammierungsfaktoren effektiv einbringen kann, ohne Spurenmutationen im Genom der Wirtszelle zu hinterlassen. Das PiggyBac-Transposon-System beinhaltet die Re-Exzision exogener Gene, wodurch das Problem der Insertionsmutagenese beseitigt wird.

Stimulus-induzierte Akquisition von Pluripotenzzellen

Im Januar 2014 wurden zwei Artikel veröffentlicht, in denen behauptet wurde, dass eine Art pluripotenter Stammzellen erzeugt werden kann, indem die Zellen bestimmten Stressarten ausgesetzt werden (bakterielles Toxin, ein niedriger pH-Wert von 5,7 oder physikalischer Druck); die resultierenden Zellen wurden STAP-Zellen genannt, für stimulus-getriggerte Akquisition von Pluripotenz . [ 51 ]

Angesichts der Schwierigkeiten, die andere Labore bei der Reproduktion der Ergebnisse der überraschenden Studie hatten, forderte einer der Koautoren im März 2014 die Rücknahme der Artikel. [ 52 ] Am 4. Juni 2014 stimmte die Erstautorin Obokata der Rücknahme beider Artikel zu [ 53 ] , nachdem bei ihr in einer Untersuchung von RIKEN vom 1. April 2014 ein wissenschaftliches Fehlverhalten festgestellt worden war. [ 54 ]

RNA-Moleküle

Mikro-RNAs sind kurze RNA-Moleküle, die an komplementäre Sequenzen auf mRNA binden und die Expression eines Gens blockieren. Die Messung von Veränderungen der Mikro-RNA-Expression in iPS-Zellen kann zur Vorhersage ihres Differenzierungspotenzials genutzt werden. [ 55 ] Die Zugabe von Mikro-RNAs kann auch zur Steigerung des iPS-Potenzials beitragen. Hierfür wurden verschiedene Mechanismen vorgeschlagen. [ 55 ] ES-Zellspezifische Mikro-RNA-Moleküle (wie miR-291, miR-294 und miR-295) erhöhen die Effizienz der induzierten Pluripotenz, indem sie nachgeschaltet von c-Myc wirken. [ 56 ] Mikro-RNAs können auch die Expression von Repressoren der vier Transkriptionsfaktoren nach Yamanaka blockieren, und es existieren möglicherweise weitere Mechanismen, die die Reprogrammierung auch ohne Zugabe exogener Transkriptionsfaktoren induzieren. [ 55 ]

Identität

Drei Keimbahnzellen/Gewebe, die aus iPS-Zellen differenziert wurden: Neuronen ( Ektoderm ), Knorpel (weicher Knochen, Mesoderm ) und Becherzellen im Darm ( Endoderm ).

Induzierte pluripotente Stammzellen ähneln natürlichen pluripotenten Stammzellen, wie beispielsweise embryonalen Stammzellen, in vielerlei Hinsicht, etwa in der Expression bestimmter Stammzellgene und -proteine, Chromatinmethylierungsmustern , Verdopplungszeit, Embryoidkörperbildung , Teratombildung , Bildung lebensfähiger Chimären sowie Potenz und Differenzierungsfähigkeit. Das volle Ausmaß ihrer Verwandtschaft zu natürlichen pluripotenten Stammzellen wird jedoch noch untersucht. [ 1 ]

Die Genexpression sowie die genomweite H3K4me3- und H3K27me3-Methylierung wiesen zwischen ES- und iPS-Zellen eine extrem hohe Ähnlichkeit auf. [ 57 ] Die generierten iPS-Zellen zeigten in folgenden Aspekten eine bemerkenswerte Ähnlichkeit mit natürlich isolierten pluripotenten Stammzellen (wie embryonalen Stammzellen der Maus und des Menschen, mESCs bzw. hESCs), wodurch die Identität, Authentizität und Pluripotenz der iPS-Zellen im Vergleich zu natürlich isolierten pluripotenten Stammzellen bestätigt wurde:

  • Zellbiologische Eigenschaften
    • Morphologie: iPS-Zellen wiesen eine ähnliche Morphologie wie ESCs auf. Jede Zelle war rund, besaß einen großen Nukleolus und wenig Zytoplasma . Auch die Kolonien der iPS-Zellen ähnelten denen der ESCs. Menschliche iPS-Zellen bildeten scharfkantige, flache und dicht gepackte Kolonien, ähnlich wie humane ESCs (hESCs), während Maus-iPS-Zellen Kolonien bildeten, die denen von Maus-ESCs ähnelten, jedoch weniger flach und stärker aggregiert waren als die von hESCs.
    • Wachstumseigenschaften: Verdopplungszeit und mitotische Aktivität sind Eckpfeiler von ESCs, da Stammzellen sich definitionsgemäß selbst erneuern müssen. iPSCs waren mitotisch aktiv, erneuerten sich aktiv selbst, proliferierten und teilten sich mit der gleichen Rate wie ESCs.
    • Stammzellmarker: iPS-Zellen exprimierten Zelloberflächenantigene, die auch auf embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) vorkommen. Humane iPS-Zellen exprimierten die für humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen) spezifischen Marker, darunter SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E und Nanog. Maus-iPS-Zellen exprimierten SSEA-1, jedoch weder SSEA-3 noch SSEA-4, ähnlich wie murine embryonale Stammzellen (mES-Zellen).
    • Stammzellgene: iPS-Zellen exprimieren Gene, die in undifferenzierten ESCs exprimiert werden, darunter Oct-3/4, Sox2, Nanog, GDF3, REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4 und hTERT.
    • Telomeraseaktivität: Telomerasen sind notwendig, um die Zellteilung über die Hayflick-Grenze von ca. 50 Zellteilungen hinaus aufrechtzuerhalten . Menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) weisen eine hohe Telomeraseaktivität auf, um Selbsterneuerung und Proliferation zu gewährleisten. Auch menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) zeigen eine hohe Telomeraseaktivität und exprimieren hTERT (humane Telomerase-Reverse-Transkriptase ), eine notwendige Komponente des Telomerase-Proteinkomplexes.
  • Pluripotenz: iPS-Zellen waren in der Lage, sich ähnlich wie ESCs zu vollständig differenzierten Geweben zu differenzieren.
    • Neuronale Differenzierung: iPS-Zellen wurden zu Neuronen differenziert , die βIII-Tubulin, Tyrosinhydroxylase, AADC, DAT, ChAT, LMX1B und MAP2 exprimierten. Das Vorhandensein von Katecholamin- assoziierten Enzymen deutet darauf hin, dass iPS-Zellen, ähnlich wie hES-Zellen, zu dopaminergen Neuronen differenziert werden können. Stammzellassoziierte Gene wurden nach der Differenzierung herunterreguliert.
    • Kardiale Differenzierung: iPS-Zellen wurden zu Kardiomyozyten differenziert , die spontan zu schlagen begannen. Die Kardiomyozyten exprimierten TnTc, MEF2C, MYL2A, MYHCβ und NKX2.5. Stammzellassoziierte Gene wurden nach der Differenzierung herunterreguliert.
    • Teratombildung: In immundefiziente Mäuse injizierte iPS-Zellen bildeten nach neun Wochen spontan Teratome . Teratome sind Tumoren verschiedener Zelllinien, die Gewebe aller drei Keimblätter – Endoderm , Mesoderm und Ektoderm – enthalten ; dies unterscheidet sie von anderen Tumoren, die typischerweise nur aus einem Zelltyp bestehen. Die Teratombildung ist ein wichtiger Test für Pluripotenz.
    • Embryoidkörper: In Kultur bilden humane embryonale Stammzellen (hESCs) spontan kugelförmige, embryonale Strukturen, sogenannte Embryoidkörper . Diese bestehen aus einem Kern mitotisch aktiver und differenzierender hESCs und einer Peripherie vollständig differenzierter Zellen aller drei Keimblätter. Auch induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) bilden Embryoidkörper und weisen peripher differenzierte Zellen auf.
    • Chimäre Mäuse: Menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) befinden sich natürlicherweise in der inneren Zellmasse ( Embryoblast ) von Blastozysten und differenzieren sich dort zum Embryo, während sich die Blastozystenhülle ( Trophoblast ) zu extraembryonalem Gewebe entwickelt. Der hohle Trophoblast kann keinen lebenden Embryo bilden; daher ist es notwendig, dass sich die embryonalen Stammzellen im Embryoblast differenzieren und den Embryo bilden. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) wurden mittels Mikropipette in einen Trophoblasten injiziert, und die Blastozyste wurde Empfängerweibchen übertragen. Es wurden chimäre, lebende Mäusewelpen erzeugt: Mäuse, deren Körper mit iPSC-Derivaten durchzogen ist und die einen Chimärismus von 10–90 % aufweisen.
    • Tetraploide Komplementation : Durch Injektion von iPS-Zellen aus fetalen Mausfibroblasten in tetraploide Blastozysten (die selbst nur extraembryonales Gewebe bilden können) können vollständige, nicht-chimäre, fertile Mäuse entstehen, allerdings mit geringer Erfolgsrate. [ 42 ] [ 58 ] [ 59 ] Die Effizienz der Herstellung von Mäusen aus reinen pluripotenten Stammzellen (PSC) könnte durch eine kurze Exposition der pluripotenten Stammzelllinie gegenüber einem episomalen Plasmid, das für die gentechnisch veränderten Gene Sox2 und Klf4 kodiert (SK-Cocktail), gesteigert werden. [ 30 ]
  • Epigenetische Reprogrammierung
    • Promotor-Demethylierung: Methylierung ist die Übertragung einer Methylgruppe auf eine DNA-Base, typischerweise auf ein Cytosinmolekül in einer CpG-Stelle (Cytosin/Guanin-Sequenz). Eine weitverbreitete Methylierung eines Gens beeinträchtigt dessen Expression , indem sie die Aktivität exprimierender Proteine ​​hemmt oder Enzyme rekrutiert, die die Expression stören. Somit führt die Methylierung eines Gens effektiv zu dessen Stilllegung, indem sie die Transkription verhindert. Die Promotoren von Pluripotenz-assoziierten Genen, darunter Oct-3/4, Rex1 und Nanog, wurden in iPS-Zellen demethyliert, wodurch deren Promotoraktivität sowie die aktive Förderung und Expression von Pluripotenz-assoziierten Genen in iPS-Zellen nachgewiesen wurden.
    • Globale DNA-Methylierung: Menschliche iPS-Zellen weisen eine hohe Ähnlichkeit mit ES-Zellen hinsichtlich der Methylierungsmuster ihrer Cytosine auf , mehr als mit jedem anderen Zelltyp. Allerdings zeigen etwa tausend Stellen Unterschiede zwischen verschiedenen iPS-Zelllinien. Die Hälfte dieser Unterschiede ähnelt der somatischen Zelllinie, aus der die iPS-Zellen stammen, die übrigen sind iPSC-spezifisch. Es wurden auch Dutzende von Megabasen große Regionen gefunden, in denen iPS-Zellen nicht in den ES-Zellzustand reprogrammiert werden. [ 60 ]
    • Histon-Demethylierung: Histone sind kompakte Proteine, die strukturell an DNA-Sequenzen gebunden sind und deren Aktivität durch verschiedene Chromatin-bezogene Modifikationen beeinflusst werden kann. H3-Histone, die mit Oct-3/4, Sox2 und Nanog assoziiert sind, wurden demethyliert, was auf die Expression von Oct-3/4, Sox2 und Nanog hinweist.

Sicherheit

  • Die größte Sorge hinsichtlich der potenziellen klinischen Anwendung von iPS-Zellen ist ihre Neigung zur Tumorbildung. [ 61 ] Ähnlich wie embryonale Stammzellen (ES-Zellen) bilden iPS-Zellen nach Injektion in immundefiziente Mäuse leicht Teratome . Die FDA betrachtet die Teratombildung als ein wesentliches Hindernis für die stammzellbasierte regenerative Medizin.
  • Eine neuere Studie zur motorischen Funktionserholung nach Rückenmarksverletzungen bei Mäusen zeigte, dass sich transplantierte humane induzierte pluripotente Stammzellen im Rückenmark in drei neuronale Zelllinien differenzierten. Die Zellen stimulierten das Nachwachsen des geschädigten Rückenmarks, erhielten die Myelinisierung aufrecht und bildeten Synapsen. Diese positiven Ergebnisse wurden über 112 Tage nach der Rückenmarksverletzung beobachtet, ohne dass es zur Tumorbildung kam. [ 62 ] Eine Folgestudie derselben Arbeitsgruppe zeigte jedoch, dass bestimmte Klone humaner induzierter pluripotenter Stammzellen schließlich Tumore bildeten. [ 63 ]
  • Da iPS-Zellen derzeit nur durch Modifikationen mit hoher Effizienz hergestellt werden können, gelten sie im Allgemeinen als weniger sicher und tumorerzeugender als hES-Zellen. Alle Gene, die die iPS-Zellbildung fördern, wurden auch in irgendeiner Weise mit Krebs in Verbindung gebracht. Einige dieser Gene sind bekannte Onkogene, darunter die Mitglieder der Myc-Familie. Zwar ermöglicht das Weglassen von Myc weiterhin die iPS-Zellbildung, die Effizienz sinkt jedoch um bis zu 100-fach.
  • Eine nicht-genetische Methode zur Herstellung von iPS-Zellen wurde mithilfe rekombinanter Proteine ​​demonstriert, ihre Effizienz war jedoch recht gering. [ 49 ] Verbesserungen dieser Methodik, die zu einer höheren Effizienz führen, könnten jedoch die Produktion sichererer iPS-Zellen ermöglichen. Andere Ansätze, wie die Verwendung von Adenoviren oder Plasmiden, gelten im Allgemeinen als sicherer als retrovirale Methoden.
  • Ein wichtiger Bereich für zukünftige Studien im iPSC-Feld ist die direkte Untersuchung der Tumorigenität von iPSCs mithilfe von Methoden, die den Ansätzen regenerativer Therapien ähneln. Solche Studien sind von entscheidender Bedeutung, da iPSCs nicht nur Teratome bilden, sondern auch Mäuse, die von iPSCs abstammen, eine hohe Sterblichkeitsrate durch bösartige Tumore aufweisen. [ 64 ] Eine 2010 in der Fachzeitschrift „Stem Cells“ veröffentlichte Studie zeigte, dass iPS-Zellen deutlich tumorigener sind als embryonale Stammzellen (ES-Zellen), was die Annahme stützt, dass die Sicherheit von iPS-Zellen ein ernstzunehmendes Problem darstellt. [ 65 ]
  • Bedenken hinsichtlich der Immunogenität von iPS-Zellen kamen 2011 auf, als Zhou et al. eine Studie mit einem Teratom-Bildungstest durchführten und zeigten, dass iPS-Zellen eine so starke Immunantwort auslösten, dass sie abgestoßen wurden. Als ein ähnliches Verfahren mit genetisch äquivalenten ES-Zellen durchgeführt wurde, fanden Zhou et al. jedoch Teratome , was darauf hindeutete, dass die Zellen vom Immunsystem toleriert wurden. [ 66 ] 2013 versuchten Araki et al., die Ergebnisse von Zhou et al. mit einem anderen Verfahren zu reproduzieren. Sie entnahmen Zellen aus einer Chimäre, die aus iPS-Zellklonen und einem Mausembryo gezüchtet worden war, und transplantierten dieses Gewebe in syngene Mäuse. Sie führten einen ähnlichen Versuch mit ES-Zellen anstelle von iPS-Zellklonen durch und verglichen die Ergebnisse. Die Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Unterschied in der Immunantwort zwischen iPS-Zellen und ES-Zellen. Auch Araki et al. berichteten von einer geringen oder gar keiner Immunantwort für beide Zelllinien. [ 67 ] Daher konnten Araki et al. nicht zu demselben Schluss kommen wie Zhou et al.

Medizinische Forschung

Die Herstellung von iPS-Zellen bleibt aufgrund der sechs oben genannten Probleme eine Herausforderung. Ein zentraler Zielkonflikt besteht zwischen Effizienz und genomischer Integration. Die meisten Methoden, die nicht auf der Integration von Transgenen beruhen, sind ineffizient, während jene, die auf der Integration von Transgenen basieren, trotz zahlreicher erprobter Techniken und Methoden mit Problemen wie unvollständiger Reprogrammierung und Tumorentstehung konfrontiert sind. Ein weiterer wichtiger Ansatzpunkt ist die proteomische Charakterisierung von iPS-Zellen. [ 59 ] Weitere Studien und neue Strategien sollten optimale Lösungen für die fünf Hauptprobleme hervorbringen. Ein möglicher Ansatz wäre die Kombination der positiven Eigenschaften dieser Strategien zu einer letztendlich effektiven Technik für die Reprogrammierung von Zellen zu iPS-Zellen.

Ein weiterer Ansatz ist die Verwendung von aus Patienten gewonnenen iPS-Zellen, um therapeutische Wirkstoffe zu identifizieren, die einen Phänotyp retten können. Beispielsweise zeigen iPS-Zelllinien von Patienten mit ektodermaler Dysplasie (EEC), bei der das p63 -Gen mutiert ist, eine abnorme Epitheldifferenzierung, die durch eine kleine Substanz teilweise aufgehoben werden konnte. [ 68 ]

Krankheitsmodellierung und Arzneimittelentwicklung

Ein attraktives Merkmal humaner iPS-Zellen ist die Möglichkeit, sie von erwachsenen Patienten zu gewinnen, um die zellulären Grundlagen menschlicher Erkrankungen zu erforschen. Da iPS-Zellen selbsterneuerungsfähig und pluripotent sind, stellen sie eine theoretisch unbegrenzte Quelle patienteneigener Zellen dar, die sich in jeden Zelltyp des Körpers differenzieren lassen. Dies ist besonders wichtig, da viele andere Arten von menschlichen Zellen, die von Patienten stammen, nach wenigen Passagen in der Laborkultur ihr Wachstum einstellen. iPS-Zellen wurden für eine Vielzahl menschlicher genetischer Erkrankungen generiert, darunter häufige Erkrankungen wie das Down-Syndrom und die polyzystische Nierenerkrankung. [ 69 ] [ 70 ] [ 71 ] In vielen Fällen weisen die patienteneigenen iPS-Zellen zelluläre Defekte auf, die bei iPS-Zellen gesunder Probanden nicht beobachtet werden, wodurch Einblicke in die Pathophysiologie der Erkrankung gewonnen werden können. [ 72 ] [ 73 ] Im Jahr 2012 wurde das internationale Kooperationsprojekt StemBANCC ins Leben gerufen, um eine Sammlung von iPS-Zelllinien für das Wirkstoff-Screening verschiedener Erkrankungen aufzubauen. Das von der Universität Oxford geleitete Projekt bündelte Mittel und Ressourcen von zehn Pharmaunternehmen und 23 Universitäten. Ziel ist die Erstellung einer Bibliothek von 1.500 iPS-Zelllinien, die in frühen Arzneimitteltests eingesetzt werden sollen, indem sie ein simuliertes menschliches Krankheitsmilieu bereitstellen. [ 74 ] Darüber hinaus ermöglichte die Kombination von hiPSC-Technologie mit niedermolekularen oder genetisch kodierten Spannungs- und Kalziumindikatoren eine groß angelegte und hocheffiziente Plattform für das Screening von Arzneimitteln zur Untersuchung der kardiovaskulären Sicherheit. [ 75 ] [ 76 ] [ 77 ] [ 78 ] [ 79 ]

Organsynthese

Japanische Forscher berichteten über den Machbarkeitsnachweis, dass aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) menschliche Organe für Transplantationen gewonnen werden können. Menschliche „ Leberknospen “ (iPSC-LBs) wurden aus einer Mischung dreier verschiedener Stammzelltypen gezüchtet: Hepatozyten (für die Leberfunktion), die aus iPS-Zellen gewonnen wurden; endotheliale Stammzellen (zur Bildung der Blutgefäßauskleidung ) aus Nabelschnurblut ; und mesenchymale Stammzellen (zur Bildung von Bindegewebe ). Dieser neue Ansatz ermöglicht es verschiedenen Zelltypen, sich selbstorganisiert zu einem komplexen Organ zusammenzufügen und so die Prozesse der fetalen Entwicklung nachzuahmen . Nach mehrtägigem Wachstum in vitro wurden die Leberknospen in Mäuse transplantiert. Die „Leber“ verband sich schnell mit den Blutgefäßen des Wirts und wuchs weiter. Besonders wichtig ist, dass sie normale Leberfunktionen ausführte, darunter die Verstoffwechselung von Medikamenten und die Produktion leberspezifischer Proteine. Zukünftige Studien werden die Lebensdauer des transplantierten Organs im Wirtsorganismus (Integrationsfähigkeit bzw. Vermeidung von Abstoßungsreaktionen ) und die mögliche Entwicklung von Tumoren untersuchen . [ 80 ] [ 81 ]

Organregeneration

Im Jahr 2021 wurde an Mäusen ein auf der Reprogrammierung von schaltbaren Yamanaka-Faktoren basierender Ansatz zur Regeneration geschädigter Herzen ohne Tumorbildung demonstriert. Der Eingriff war erfolgreich, wenn er unmittelbar vor oder nach einem Herzinfarkt durchgeführt wurde. [ 82 ] Im Jahr 2020 transplantierte Japan erstmals im Labor gezüchtete Herzzellen in einen menschlichen Patienten. [ 83 ]

Gewebereparatur

Embryonale Nabelschnurblutzellen wurden mithilfe von Plasmid-DNA in pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) differenziert. Mithilfe der Zelloberflächenmarker CD31 und CD146 für Endothel- und Perizytenzellen identifizierten die Forscher „vaskuläre Vorläuferzellen“, die qualitativ hochwertigen, multipotenten vaskulären Stammzellen. Nach direkter Injektion der iPS-Zellen in den Glaskörper der geschädigten Netzhaut von Mäusen siedelten sich die Stammzellen in der Netzhaut an, vermehrten sich und reparierten die Blutgefäße . [ 84 ] [ 85 ]

Es zeigte sich, dass markierte, aus iPS-Zellen gewonnene NSCs, die in Labortiere mit Hirnläsionen injiziert wurden, zu den Läsionen wanderten und dass eine gewisse Verbesserung der motorischen Funktion beobachtet wurde. [ 86 ]

Kardiomyozyten

Schlagende Herzmuskelzellen, sogenannte iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten , können mithilfe chemisch definierter Differenzierungsprotokolle massenhaft hergestellt werden. [ 87 ] [ 88 ] Diese Protokolle modulieren typischerweise dieselben Signalwege der Herzentwicklung . [ 89 ] Da diese iPSC-Kardiomyozyten denselben genetischen Hintergrund wie der Patient aufweisen, von dem sie stammen, können sie genetische Arrhythmien und kardiale Arzneimittelreaktionen nachbilden . [ 90 ] [ 91 ] [ 92 ] [ 93 ]

Im Juni 2014 erhielt Takara Bio von iHeart Japan, einem Joint Venture des iPS-Zellforschungsinstituts der Universität Kyoto, einen Technologietransfer, der es dem Unternehmen ermöglichte, Technologien und Patente zur Differenzierung von iPS-Zellen in Kardiomyozyten exklusiv in Asien zu nutzen. Das Unternehmen kündigte an, Kardiomyozyten an Pharmaunternehmen und Universitäten zu verkaufen, um die Entwicklung neuer Medikamente gegen Herzkrankheiten zu unterstützen. [ 94 ]

Am 9. März 2018 genehmigte der Ausschuss für Regenerative Medizin der Universität Osaka offiziell den weltweit ersten klinischen Forschungsplan zur Transplantation eines aus iPS-Zellen hergestellten „Myokardgewebes“ in das Herz von Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz. Die Universität Osaka gab am selben Tag bekannt, einen entsprechenden Antrag beim Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Soziales eingereicht zu haben.

Am 16. Mai 2018 wurde der Plan für die klinische Studie von der Expertengruppe des Ministeriums für Gesundheit, Arbeit und Soziales unter Auflagen genehmigt. [ 95 ] [ 96 ]

Im Oktober 2019 entwickelte eine Gruppe an der Universität Okayama ein Modell der ischämischen Herzkrankheit unter Verwendung von aus iPS-Zellen differenzierten Kardiomyozyten. [ 97 ]

Rote Blutkörperchen

Obwohl ein halber Liter gespendetes Blut etwa zwei Billionen rote Blutkörperchen enthält und weltweit über 107 Millionen Blutspenden gesammelt werden, besteht weiterhin ein akuter Bedarf an Bluttransfusionen. Im Jahr 2014 wurden beim schottischen nationalen Blutspendedienst rote Blutkörperchen der Blutgruppe O aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) synthetisiert. Die Zellen wurden zunächst zu Mesodermzellen , dann zu Blutzellen und schließlich zu roten Blutkörperchen differenziert. Im letzten Schritt wurden sie dazu gebracht, ihre Zellkerne abzustoßen und vollständig auszureifen. Blut der Blutgruppe O kann allen Patienten transfundiert werden. Klinische Studien am Menschen sollten voraussichtlich nicht vor 2016 beginnen. [ 98 ]

Klinische Studien

Die erste klinische Studie am Menschen mit autologen iPS-Zellen wurde vom japanischen Gesundheitsministerium genehmigt und sollte 2014 am Riken Center for Developmental Biology in Kobe durchgeführt werden . Die Studie wurde jedoch nach Inkrafttreten der neuen japanischen Gesetze zur regenerativen Medizin im November 2015 ausgesetzt. [ 99 ] Konkret wurden bestehende Richtlinien verschärft und erhielten Gesetzeskraft (zuvor lediglich Empfehlungen). [ 100 ] Aus Hautzellen von sechs Patienten mit feuchter altersbedingter Makuladegeneration gewonnene iPS-Zellen wurden so reprogrammiert, dass sie sich zu retinalen Pigmentepithelzellen (RPE-Zellen) differenzierten. Das Zellblatt sollte in die betroffene Netzhaut transplantiert werden , nachdem das degenerierte RPE-Gewebe entfernt worden war. Die Überwachung der Sicherheit und der Sehverbesserung sollte ein bis drei Jahre dauern. [ 101 ] [ 102 ]

Im März 2017 gelang einem Team um Masayo Takahashi die erste erfolgreiche Transplantation von iPS-abgeleiteten Netzhautzellen eines Spenders in das Auge eines Patienten mit fortgeschrittener Makuladegeneration. [ 103 ] Es wurde jedoch berichtet, dass inzwischen Komplikationen aufgetreten sind. [ 104 ] Die Vorteile der Verwendung autologer iPS-Zellen liegen darin, dass theoretisch kein Abstoßungsrisiko besteht und embryonale Stammzellen nicht benötigt werden. Allerdings stammten diese iPS-Zellen von einem anderen Menschen. [ 102 ]

Neue klinische Studien mit iPS-Zellen laufen derzeit nicht nur in Japan, sondern auch in den USA und Europa. [ 105 ] Recherchen im Studienregister Clinicaltrials.gov aus dem Jahr 2021 identifizierten 129 Studieneinträge, die iPS-Zellen erwähnten, wobei es sich jedoch zumeist um nicht-interventionelle Studien handelte. [ 106 ]

Im Jahr 2026 empfahl der japanische Arzneimittelrat dem Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Soziales, die bedingte Zulassung für zwei allogene, auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) basierende Therapeutika zu verlängern: Amchepry für Parkinson und ReHeart für schwere Herzinsuffizienz. [ 107 ]

Strategie zur Gewinnung universeller iPS-Zellen

Um iPSC-basierte regenerative Medizintechnologien mehr Patienten zugänglich zu machen, ist die Entwicklung universeller iPSCs erforderlich, die unabhängig von HLA-Haplotypen transplantiert werden können . Die aktuelle Strategie zur Erzeugung universeller iPSCs verfolgt zwei Hauptziele: die Unterdrückung der HLA-Expression und die Verhinderung von NK-Zell -Angriffen aufgrund der HLA- Deletion . Die Deletion der B2M- und CIITA -Gene mittels des CRISPR/Cas9- Systems unterdrückt nachweislich die Expression von HLA-Klasse I bzw. Klasse II. Um NK-Zell-Angriffe zu vermeiden, wurde die Transduktion von NK-Zell-inhibierenden Liganden wie HLA-E und CD47 eingesetzt. [ 108 ] HLA-C bleibt unverändert, da die 12 häufigen HLA-C-Allele 95 % der Weltbevölkerung abdecken. [ 108 ]

Anti-Aging-Eigenschaften

Eine multipotente mesenchymale Stammzelle, die zur Pluripotenz induziert wird, birgt großes Potenzial zur Verlangsamung oder Umkehrung von Alterungsprozessen. Solche Anti-Aging-Eigenschaften wurden in ersten klinischen Studien im Jahr 2017 nachgewiesen. [ 109 ] Im Jahr 2020 kamen Forscher der Stanford University nach Untersuchungen an älteren Mäusen zu dem Schluss, dass sich alte menschliche Zellen durch die Einwirkung der Yamanaka-Faktoren verjüngen und von jüngeren Zellen kaum noch unterscheiden lassen könnten. [ 110 ]

Hypoimmunogene pluripotente Stammzellen

Eine 2025 veröffentlichte Übersichtsarbeit untersucht die Entwicklung hypoimmunogener pluripotenter Stammzellen (hPSCs) mithilfe fortschrittlicher Genomeditierungstechniken. Ziel ist die Reduzierung des Risikos von Immunreaktionen in der allogenen Zelltherapie. Diese hPSCs sind so konstruiert, dass sie keine MHC-Klasse-I- und -II-Moleküle exprimieren, jedoch immunmodulatorische Gene wie PD-L1, CD47 und HLA-G. Diese Kombination verbessert die Immunflucht und unterstützt das Konzept universeller Spenderzellen, die keine HLA-Übereinstimmung erfordern. Die Integration von Suizidgensystemen, wie z. B. induzierbarer Caspase-9, erhöht die Sicherheit zusätzlich, indem sie die selektive Eliminierung von Zellen im Falle einer malignen Erkrankung ermöglicht. Diese Strategien sollen die Sicherheit, Skalierbarkeit und Zugänglichkeit regenerativer Therapien verbessern. [ 111 ]

Siehe auch

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