Gamma- Phage , ein Beispiel für Viruspartikel (visualisiert durch Elektronenmikroskopie)

Die Virologie ist die wissenschaftliche Untersuchung biologischer Viren . Sie ist ein Teilgebiet der Mikrobiologie , das sich mit deren Nachweis, Struktur, Klassifizierung und Evolution, ihren Infektionsmethoden und der Nutzung von Wirtszellen zur Vermehrung, ihrer Wechselwirkung mit der Physiologie und Immunität des Wirtsorganismus, den von ihnen verursachten Krankheiten, den Techniken zu ihrer Isolierung und Kultivierung sowie ihrer Anwendung in Forschung und Therapie befasst .

Die Identifizierung des Erregers der Tabakmosaikkrankheit (TMV) als neuartigen Krankheitserreger durch Martinus Beijerinck (1898) gilt heute als offizieller Beginn der Virologie als eigenständige Disziplin, die sich von der Bakteriologie abgrenzt . Beijerinck erkannte, dass die Ursache weder eine bakterielle noch eine Pilzinfektion war, sondern etwas völlig anderes. Er verwendete den Begriff „Virus“ , um den mysteriösen Erreger in seinem Werk „ contagium vivum fluidum “ („ansteckende Lebensflüssigkeit“) zu beschreiben . Rosalind Franklin entschlüsselte 1955 die vollständige Struktur des Tabakmosaikvirus.

Ein Hauptgrund für die Erforschung von Viren liegt darin, dass sie zahlreiche Infektionskrankheiten bei Pflanzen und Tieren verursachen. [ 1 ] Die Untersuchung der Mechanismen, durch die Viren Krankheiten auslösen, wird als virale Pathogenese bezeichnet . Der Grad der Krankheitsverursachung durch ein Virus wird als seine Virulenz bezeichnet . [ 2 ] Diese Forschungsgebiete werden als Pflanzenvirologie , Tiervirologie und Human- bzw. medizinische Virologie bezeichnet . [ 3 ]

Die Virologie entstand in einer Zeit, als es weder Methoden zur Vermehrung noch zur Visualisierung von Viren oder spezifische Labortests für Virusinfektionen gab. Die Methoden zur Trennung viraler Nukleinsäuren ( RNA und DNA ) und Proteine , die heute die Grundlage der Virologie bilden, existierten damals noch nicht. Mittlerweile gibt es zahlreiche Methoden, um die Struktur und Funktion von Viren und ihren Bestandteilen zu untersuchen. Tausende verschiedener Viren sind bekannt, und Virologen spezialisieren sich häufig entweder auf Viren, die Pflanzen, Bakterien und andere Mikroorganismen oder Tiere infizieren. Viren, die Menschen infizieren, werden heute von medizinischen Virologen erforscht. Die Virologie ist ein weites Feld, das Biologie, Gesundheit, Tierschutz, Landwirtschaft und Ökologie umfasst.

Geschichte

Ein älterer, bebrillter Mann im Anzug sitzt auf einer Bank an einem großen Fenster. Die Bank ist mit kleinen Flaschen und Reagenzgläsern bedeckt. An der Wand hinter ihm hängt eine große, altmodische Uhr, darunter befinden sich vier kleine, geschlossene Regale mit vielen ordentlich beschrifteten Flaschen.
Martinus Beijerinck in seinem Labor im Jahr 1921

Louis Pasteur konnte keinen Erreger für Tollwut finden und spekulierte über einen Krankheitserreger, der zu klein war, um mikroskopisch sichtbar zu sein. [ 4 ] 1884 erfand der französische Mikrobiologe Charles Chamberland den Chamberland-Filter (oder Pasteur-Chamberland-Filter) mit Poren, die klein genug waren, um alle Bakterien aus einer hindurchgeleiteten Lösung zu entfernen. [ 5 ] 1892 nutzte der russische Biologe Dmitri Iwanowski diesen Filter, um das heute als Tabakmosaikvirus bekannte Virus zu untersuchen : Zerkleinerte Blattextrakte infizierter Tabakpflanzen blieben selbst nach der Filtration zur Entfernung der Bakterien infektiös. Iwanowski vermutete, die Infektion könnte durch ein von Bakterien produziertes Toxin verursacht werden , verfolgte diese Idee jedoch nicht weiter. [ 6 ] Damals ging man davon aus, dass alle infektiösen Erreger von Filtern zurückgehalten und auf einem Nährmedium vermehrt werden könnten – dies war Teil der Keimtheorie der Krankheiten . [ 7 ]

1898 wiederholte der niederländische Mikrobiologe Martinus Beijerinck die Experimente und war überzeugt, dass die filtrierte Lösung eine neue Form eines Infektionserregers enthielt. [ 8 ] Er beobachtete, dass sich der Erreger nur in sich teilenden Zellen vermehrte. Da seine Experimente jedoch nicht zeigten, dass er aus Partikeln bestand, nannte er ihn „ contagium vivum fluidum“ (löslicher lebender Keim) und führte den Begriff „Virus“ wieder ein . Beijerinck vertrat die Ansicht, Viren seien flüssiger Natur – eine Theorie, die später von Wendell Stanley widerlegt wurde , der ihre Partikelstruktur nachwies. [ 6 ] Im selben Jahr filterten Friedrich Loeffler und Paul Frosch das erste tierische Virus, das Aphthovirus (den Erreger der Maul- und Klauenseuche ), durch einen ähnlichen Filter. [ 9 ]

Anfang des 20. Jahrhunderts entdeckte der englische Bakteriologe Frederick Twort 1915 eine Gruppe von Viren, die Bakterien infizieren und heute als Bakteriophagen (oder kurz „Phagen“) bekannt sind. [ 10 ] [ 11 ] Der französisch-kanadische Mikrobiologe Félix d’Herelle verkündete 1917 seine unabhängige Entdeckung der Bakteriophagen. D’Herelle beschrieb Viren, die, wenn sie Bakterien auf einer Agarplatte zugesetzt wurden , Bereiche mit abgestorbenen Bakterien bildeten. Er verdünnte eine Suspension dieser Viren präzise und entdeckte, dass die höchsten Verdünnungen (niedrigste Viruskonzentrationen) nicht alle Bakterien abtöteten, sondern abgegrenzte Bereiche mit toten Organismen bildeten. Durch Zählen dieser Bereiche und Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor konnte er die Anzahl der Viren in der ursprünglichen Suspension berechnen. [ 12 ] Phagen wurden als potenzielle Behandlungsmethode für Krankheiten wie Typhus und Cholera gefeiert , doch mit der Entwicklung des Penicillins geriet dieses Versprechen in Vergessenheit . Die Entwicklung von Antibiotikaresistenzen bei Bakterien hat das Interesse an der therapeutischen Anwendung von Bakteriophagen neu entfacht. [ 13 ]

Ende des 19. Jahrhunderts wurden Viren anhand ihrer Infektiosität , ihrer Fähigkeit, Filter zu passieren, und ihrer Notwendigkeit lebender Wirte definiert. Viren konnten bis dahin nur in Pflanzen und Tieren vermehrt werden. 1906 entwickelte Ross Granville Harrison eine Methode zur Gewebezüchtung in Lymphe , und 1913 nutzten E. Steinhardt, C. Israeli und R. A. Lambert diese Methode, um Vacciniavirus in Fragmenten von Meerschweinchenhornhautgewebe zu züchten. [ 14 ] 1928 gelang es H. B. Maitland und M. C. Maitland, Vacciniavirus in Suspensionen von zerkleinerten Hühnernieren zu züchten. Ihre Methode fand erst in den 1950er Jahren breite Anwendung, als Poliovirus in großem Maßstab für die Impfstoffproduktion vermehrt wurde. [ 15 ]

Ein weiterer Durchbruch gelang 1931, als der amerikanische Pathologe Ernest William Goodpasture und Alice Miles Woodruff Influenzaviren und mehrere andere Viren in befruchteten Hühnereiern züchteten. [ 16 ] 1949 gelang es John Franklin Enders , Thomas Weller und Frederick Robbins, Polioviren in Zellkulturen aus abgetriebenem menschlichem Embryonalgewebe zu züchten. [ 17 ] Es war das erste Virus, das ohne die Verwendung von festem tierischem Gewebe oder Eiern gezüchtet wurde. Diese Arbeit ermöglichte es Hilary Koprowski und später Jonas Salk , einen wirksamen Polioimpfstoff zu entwickeln . [ 18 ]

Die ersten Bilder von Viren wurden 1931 mit der Erfindung der Elektronenmikroskopie durch die deutschen Ingenieure Ernst Ruska und Max Knoll aufgenommen . [ 19 ] 1935 untersuchte der amerikanische Biochemiker und Virologe Wendell Meredith Stanley das Tabakmosaikvirus und stellte fest, dass es hauptsächlich aus Protein besteht. [ 20 ] Kurze Zeit später wurde dieses Virus in seine Protein- und RNA-Bestandteile aufgetrennt. [ 21 ] Das Tabakmosaikvirus war das erste Virus, das kristallisiert wurde , wodurch seine Struktur detailliert aufgeklärt werden konnte. Die ersten Röntgenbeugungsbilder des kristallisierten Virus wurden 1941 von Bernal und Fankuchen aufgenommen. Basierend auf ihren Röntgenkristallographie-Aufnahmen entdeckte Rosalind Franklin 1955 die vollständige Struktur des Virus. [ 22 ] Im selben Jahr zeigten Heinz Fraenkel-Conrat und Robley Williams , dass gereinigte Tabakmosaikvirus-RNA und ihre Proteinhülle sich selbstständig zu funktionsfähigen Viren zusammenlagern können. Dies deutet darauf hin, dass dieser einfache Mechanismus wahrscheinlich die Art und Weise ist, wie Viren in ihren Wirtszellen entstehen. [ 23 ]

The second half of the 20th century was the golden age of virus discovery, and most of the documented species of animal, plant, and bacterial viruses were discovered during these years.[24] In 1946, bovine viral diarrhoea (a pestivirus) was first described. In 1957 equine arterivirus was discovered. In 1963 the hepatitis B virus was discovered by Baruch Blumberg.[25] In 1965 Howard Temin described the first retrovirus. Reverse transcriptase, the enzyme that retroviruses use to make DNA copies of their RNA, was first described in 1970 by Temin and David Baltimore independently.[26] In 1983 Luc Montagnier's team at the Pasteur Institute in France, first isolated the retrovirus now called HIV.[27] In 1989 Michael Houghton's team at Chiron Corporation discovered hepatitis C.[28][29]

Detecting viruses

An electron microscope

There are several approaches to detecting viruses; these include the detection of virus particles (virions) or their antigens or nucleic acids and infectivity assays.

Electron microscopy

Electron micrographs of viruses. A, rotavirus; B, adenovirus; C, norovirus; and D, astrovirus.

Viruses were seen for the first time in the 1930s when electron microscopes were invented. Unlike optical microscopes that observe with visible light, these microscopes use beams of electrons, which have a much shorter wavelength and can detect objects that cannot be seen using light microscopes. The highest magnification obtainable by electron microscopes is up to 10,000,000 times[30] whereas for light microscopes it is around 1,500 times.[31]

Virologen nutzen häufig die Negativkontrastierung, um Viren sichtbar zu machen. Dabei werden die Viren in einer Lösung von Metallsalzen wie Uranacetat suspendiert. Die Metallatome sind für Elektronen undurchsichtig, und die Viren erscheinen in einem dunklen Hintergrund aus Metallatomen. [ 30 ] Diese Technik wird seit den 1950er Jahren angewendet. [ 32 ] Viele Viren wurden mithilfe dieser Technik entdeckt, und die Negativkontrast-Elektronenmikroskopie ist nach wie vor ein wertvolles Werkzeug im Repertoire eines Virologen. [ 33 ]

Die traditionelle Elektronenmikroskopie hat den Nachteil, dass Viren durch Austrocknung im Hochvakuum des Elektronenmikroskops beschädigt werden und der Elektronenstrahl selbst destruktiv wirkt. [ 30 ] In der Kryo-Elektronenmikroskopie bleibt die Struktur der Viren erhalten, indem sie in glasartiges Wasser eingebettet werden . [ 34 ] Dies ermöglicht die Bestimmung biomolekularer Strukturen mit nahezu atomarer Auflösung [ 35 ] und hat diesem Verfahren als Alternative zur Röntgenkristallographie oder NMR-Spektroskopie für die Strukturaufklärung von Viren große Aufmerksamkeit verschafft. [ 36 ]

Kryoelektronenmikroskopische Aufnahme eines Rotavirus

Wachstum in Kulturen

Viren sind obligate intrazelluläre Parasiten. Da sie sich nur innerhalb lebender Wirtszellen vermehren, werden diese Zellen für ihre Kultivierung im Labor benötigt. Für Viren, die Tiere infizieren (üblicherweise als „Tierviren“ bezeichnet), werden Zellen aus Laborzellkulturen verwendet . Früher nutzte man befruchtete Hühnereier und vermehrte die Viren auf den Membranen des Embryos. Dieses Verfahren wird noch heute bei der Herstellung einiger Impfstoffe angewendet. Für Viren, die Bakterien infizieren ( Bakteriophagen) , können die im Reagenzglas gezüchteten Bakterien direkt verwendet werden. Für Pflanzenviren können die natürlichen Wirtspflanzen oder, insbesondere wenn die Infektion nicht offensichtlich ist, sogenannte Indikatorpflanzen verwendet werden, die Infektionsanzeichen deutlicher zeigen. [ 37 ] [ 38 ]

Zytopathischer Effekt des Herpes-simplex-Virus. Die infizierten Zellen haben eine runde, ballonartige Form angenommen.

Viren, die in Zellkulturen vermehrt wurden, lassen sich indirekt über ihre schädliche Wirkung auf die Wirtszelle nachweisen. Diese zytopathischen Effekte sind oft charakteristisch für den jeweiligen Virustyp. So verursachen Herpes-simplex-Viren beispielsweise eine charakteristische „Ballonbildung“ der Zellen, typischerweise menschlicher Fibroblasten . Einige Viren, wie das Mumpsvirus, bewirken, dass sich rote Blutkörperchen von Hühnern fest an die infizierten Zellen anlagern. Dies wird als Hämadsorption bezeichnet. Manche Viren erzeugen lokalisierte Läsionen in Zellschichten, sogenannte Plaques , die für quantitative Analysen und die Identifizierung der Virusart mittels Plaque-Reduktions-Assays nützlich sind . [ 39 ] [ 40 ]

Viren, die in Zellkulturen gezüchtet werden, dienen zur Messung ihrer Empfindlichkeit gegenüber validierten und neuartigen antiviralen Medikamenten . [ 41 ]

Serologie

Viren sind Antigene , die die Produktion von Antikörpern induzieren . Diese Antikörper können in Laboren zur Untersuchung von Viren eingesetzt werden. Verwandte Viren reagieren häufig mit den Antikörpern anderer Viren, und einige Viren können anhand der Antikörper benannt werden, mit denen sie reagieren. Die Verwendung der Antikörper, die früher ausschließlich aus dem Serum (Blutflüssigkeit) von Tieren gewonnen wurden, wird als Serologie bezeichnet . [ 42 ] Sobald eine Antikörperreaktion in einem Test stattgefunden hat, sind weitere Methoden erforderlich, um diese zu bestätigen. Ältere Methoden umfassten Komplementbindungstests [ 43 ] , Hämagglutinationshemmung und Virusneutralisation . [ 44 ] Neuere Methoden verwenden Enzymimmunoassays (EIA). [ 45 ]

In den Jahren vor der Erfindung der PCR wurde die Immunfluoreszenz zur schnellen Bestätigung von Virusinfektionen eingesetzt. Es handelt sich um einen virusspezifischen Infektionsnachweis, da Antikörper verwendet werden. Die Antikörper sind mit einem lumineszierenden Farbstoff markiert, und bei Verwendung eines optischen Mikroskops mit einer modifizierten Lichtquelle leuchten infizierte Zellen im Dunkeln. [ 46 ]

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und andere Nukleinsäure-Nachweismethoden

Die PCR ist eine Standardmethode zum Nachweis von Viren in allen Spezies, einschließlich Pflanzen und Tieren. Sie funktioniert durch den Nachweis von virusspezifischer RNA oder DNA. Sie ist sehr sensitiv und spezifisch, kann aber leicht durch Kontamination beeinträchtigt werden. Die meisten Tests in der Veterinär- und Humanvirologie basieren auf der PCR oder ähnlichen Methoden wie der transkriptionsvermittelten Amplifikation (TMA) . Tritt ein neues Virus auf, wie beispielsweise das COVID-19-Coronavirus, kann schnell ein spezifischer Test entwickelt werden, sofern das virale Genom sequenziert und einzigartige Bereiche der viralen DNA oder RNA identifiziert wurden. [ 47 ] Die Entwicklung mikrofluidischer Tests ermöglichte die Automatisierung der meisten dieser Tests. [ 48 ] Trotz ihrer Spezifität und Sensitivität hat die PCR den Nachteil, dass sie nicht zwischen infektiösen und nicht-infektiösen Viren unterscheidet. Daher müssen sogenannte „Heilungstests“ bis zu 21 Tage verzögert werden, damit verbliebene virale Nukleinsäure aus dem Infektionsherd abgebaut werden kann. [ 49 ]

Diagnostische Tests

In Laboren basieren viele der diagnostischen Tests zum Nachweis von Viren auf Nukleinsäureamplifikationsmethoden wie der PCR. Andere Tests, wie Elektronenmikroskopie und Enzymimmunoassays , weisen Viren oder deren Bestandteile nach . Sogenannte Heimtests oder Selbsttests sind meist Lateral-Flow-Tests , die Viren mithilfe eines markierten monoklonalen Antikörpers nachweisen . [ 50 ] Diese werden auch in der Landwirtschaft, der Lebensmittelwissenschaft und den Umweltwissenschaften eingesetzt. [ 51 ]

Quantifizierung und Viruslasten

Die Zählung von Viren (Quantifizierung) spielte schon immer eine wichtige Rolle in der Virologie und ist zentral für die Kontrolle einiger Infektionen beim Menschen geworden, bei denen die Viruslast gemessen wird. [ 52 ] Es gibt zwei grundlegende Methoden: solche, die die vollständig infektiösen Viruspartikel zählen, sogenannte Infektiositätstests, und solche, die alle Partikel einschließlich der defekten zählen. [ 30 ]

Infektionstests

Die Plaques in den Zellen verursachten das Herpes-simplex-Virus. Die Zellen wurden fixiert und blau gefärbt.

Infektionsassays messen die Menge (Konzentration) infektiöser Viren in einer Probe bekannten Volumens. [ 53 ] Als Wirtszellen werden Pflanzen oder Kulturen von Bakterien- oder Tierzellen verwendet. Labortiere wie Mäuse werden insbesondere in der Veterinärvirologie eingesetzt. [ 54 ] Diese Assays sind entweder quantitativ, wobei die Ergebnisse auf einer kontinuierlichen Skala dargestellt werden, oder quantal, wobei ein Ereignis entweder eintritt oder nicht. Quantitative Assays liefern absolute Werte , während quantale Assays eine statistische Wahrscheinlichkeit angeben, beispielsweise das Volumen der Testprobe, das erforderlich ist, um sicherzustellen, dass 50 % der Wirtszellen, Pflanzen oder Tiere infiziert werden. Dies wird als mittlere infektiöse Dosis ( ID<sub> 50</sub> ) bezeichnet . [ 55 ] Infektiöse Bakteriophagen können gezählt werden, indem man sie auf Bakterienkulturen in Petrischalen ausbringt. Bei niedrigen Konzentrationen bilden die Viren Löcher in der Bakterienkultur, die gezählt werden können. Die Anzahl der Viren wird dann in plaquebildenden Einheiten (Plaque-bildenden Einheiten, PFU) angegeben . Für die Bakteriophagen, die sich in Bakterien vermehren, die nicht in Kulturen angezüchtet werden können, werden Viruslastbestimmungen durchgeführt. [ 56 ]

Immunfluoreszenz: Mit Rotavirus infizierte Zellen (oben) und nicht infizierte Zellen (unten)

Der Fokusbildungstest (Focus Forming Assay, FFA) ist eine Variante des Plaque-Tests. Anstatt auf Zelllyse zur Detektion der Plaquebildung zu setzen, verwendet der FFA Immunfärbetechniken mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die spezifisch für ein virales Antigen sind. So lassen sich infizierte Wirtszellen und infektiöse Viruspartikel nachweisen, bevor sich eine Plaque bildet. Der FFA eignet sich besonders zur Quantifizierung von Viren, die die Zellmembranen nicht lysieren, da diese Viren für den Plaque-Test ungeeignet wären. Wie beim Plaque-Test werden Wirtszellmonolayer mit verschiedenen Verdünnungen der Virusprobe infiziert und für eine relativ kurze Zeit (z. B. 24–72 Stunden) unter einem halbfesten Überzugsmedium inkubiert. Dieses Medium hemmt die Ausbreitung des infektiösen Virus und führt zur Bildung lokalisierter Cluster (Foci) infizierter Zellen. Anschließend werden die Platten mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen ein virales Antigen inkubiert, und die Anzahl der Foci wird mittels Fluoreszenzmikroskopie gezählt und quantifiziert. Die FFA-Methode liefert in der Regel schneller Ergebnisse als Plaque- oder TCID<sub> 50 </sub>-Tests, kann aber aufgrund der benötigten Reagenzien und Geräte teurer sein. Die Testdauer hängt auch von der Größe des zu analysierenden Bereichs ab. Ein größerer Bereich erfordert mehr Zeit, kann aber eine genauere Darstellung der Probe ermöglichen. Die Ergebnisse der FFA werden in Fokus-bildenden Einheiten pro Milliliter (FFU/ml) angegeben. [ 57 ]

Viruslastbestimmungen

Bei der Bestimmung der infektiösen Viruspartikel (Plaque-Assay, Focus-Assay) bezieht sich der Virustiter häufig auf die Konzentration infektiöser Viruspartikel, die sich von der Gesamtmenge der Viruspartikel unterscheidet. Viruslastbestimmungen zählen üblicherweise die Anzahl der vorhandenen Virusgenome anstelle der Partikelanzahl und verwenden PCR- ähnliche Methoden . [ 58 ] Viruslastbestimmungen sind wichtig für die Kontrolle von HIV-Infektionen. [ 59 ] Diese vielseitige Methode kann auch für Pflanzenviren eingesetzt werden. [ 60 ] [ 61 ]

Molekularbiologie

Die molekulare Virologie befasst sich mit Viren auf der Ebene von Nukleinsäuren und Proteinen. Die von Molekularbiologen entwickelten Methoden haben sich in der Virologie allesamt als nützlich erwiesen. Aufgrund ihrer geringen Größe und relativ einfachen Struktur eignen sich Viren ideal für die Untersuchung mit diesen Techniken.

Reinigung von Viren und ihren Komponenten

Cäsiumchlorid-Lösung (CsCl) und zwei morphologische Rotavirus -Typen . Nach Zentrifugation bei 100.000 g bildet sich in der CsCl-Lösung ein Dichtegradient, und die Viruspartikel trennen sich entsprechend ihrer Dichte. Das Röhrchen ist 10 cm hoch. Die Viren bilden die beiden nahe beieinander liegenden „milchigen“ Zonen. [ 62 ]

Für weiterführende Untersuchungen müssen im Labor gezüchtete Viren gereinigt werden, um Verunreinigungen aus den Wirtszellen zu entfernen. Die verwendeten Methoden haben oft den Vorteil, dass sie die Viren konzentrieren, was ihre Untersuchung erleichtert.

Zentrifugation

Zentrifugen werden häufig zur Reinigung von Viren eingesetzt. Langsamlaufende Zentrifugen mit einer maximalen Drehzahl von 10.000 Umdrehungen pro Minute (U/min) sind nicht leistungsstark genug, um Viren zu konzentrieren. Ultrazentrifugen hingegen , mit einer maximalen Drehzahl von etwa 100.000 U/min, sind dazu in der Lage. Dieser Unterschied wird in einem Verfahren namens Differenzialzentrifugation genutzt . Bei diesem Verfahren werden die größeren und schwereren Verunreinigungen durch Zentrifugation bei niedriger Drehzahl aus einem Virusgemisch entfernt. Die Viren, die klein und leicht sind und in Suspension bleiben, werden anschließend durch Zentrifugation bei hoher Drehzahl konzentriert. [ 63 ]

Nach der Differenzialzentrifugation bleiben Virussuspensionen häufig mit Partikeln verunreinigt, die denselben Sedimentationskoeffizienten aufweisen und durch das Verfahren nicht entfernt werden. In diesen Fällen wird eine modifizierte Zentrifugation, die sogenannte Dichtegradientenzentrifugation , angewendet. Dabei werden die aus der Differenzialzentrifugation gewonnenen Viren erneut mehrere Stunden lang mit sehr hoher Geschwindigkeit in dichten Zucker- oder Salzlösungen zentrifugiert, die während der Zentrifugation im Röhrchen einen Dichtegradienten von niedrig nach hoch bilden. In manchen Fällen werden vorgeformte Gradienten verwendet, indem Lösungen mit stetig abnehmender Dichte sorgfältig übereinander geschichtet werden. Ähnlich wie ein Objekt im Toten Meer können die Viruspartikel trotz der Zentrifugalkraft nicht in Lösungen höherer Dichte absinken und bilden im Röhrchen diskrete, oft sichtbare, konzentrierte Virusschichten. Für diese Lösungen wird häufig Cäsiumchlorid verwendet, da es relativ inert ist, aber bei hoher Geschwindigkeit in einer Ultrazentrifuge leicht einen Gradienten bildet. [ 62 ] Die Dichtegradientenzentrifugation kann auch zur Reinigung von Virusbestandteilen wie Nukleinsäuren oder Proteinen eingesetzt werden. [ 64 ]

Elektrophorese

Polyacrylamid-Gelelektrophorese von mit Coomassie-Blau gefärbten Rotavirusproteinen

The separation of molecules based on their electric charge is called electrophoresis. Viruses and all their components can be separated and purified using this method. This is usually done in a supporting medium such as agarose and polyacrylamide gels. The separated molecules are revealed using stains such as coomasie blue, for proteins, or ethidium bromide for nucleic acids. In some instances the viral components are rendered radioactive before electrophoresis and are revealed using photographic film in a process known as autoradiography.[65]

Sequencing of viral genomes

As most viruses are too small to be seen by a light microscope, sequencing is one of the main tools in virology to identify and study the virus. Traditional Sanger sequencing and next-generation sequencing (NGS) are used to sequence viruses in basic and clinical research, as well as for the diagnosis of emerging viral infections, molecular epidemiology of viral pathogens, and drug-resistance testing. There are more than 2.3 million unique viral sequences in GenBank.[66] NGS has surpassed traditional Sanger as the most popular approach for generating viral genomes.[66] Viral genome sequencing as become a central method in viral epidemiology and viral classification.

Phylogenetic analysis

Data from the sequencing of viral genomes can be used to determine evolutionary relationships and this is called phylogenetic analysis.[67] Software, such as PHYLIP, is used to draw phylogenetic trees. This analysis is also used in studying the spread of viral infections in communities (epidemiology).[68]

Cloning

Wenn gereinigte Viren oder virale Komponenten für Diagnosetests oder Impfstoffe benötigt werden, kann die Klonierung anstelle der Virusvermehrung eingesetzt werden. [ 69 ] Zu Beginn der COVID-19-Pandemie ermöglichte die Verfügbarkeit der RNA-Sequenz des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS- CoV-2 ) die schnelle Herstellung von Tests. [ 70 ] Es gibt mehrere bewährte Methoden zur Klonierung von Viren und ihren Komponenten. Häufig werden kleine DNA-Abschnitte, sogenannte Klonierungsvektoren, verwendet. Am häufigsten werden labormodifizierte Plasmide (kleine, ringförmige DNA-Moleküle, die von Bakterien produziert werden) eingesetzt. Die virale Nukleinsäure oder ein Teil davon wird in das Plasmid eingefügt, welches anschließend von Bakterien vervielfältigt wird. Diese rekombinante DNA kann dann zur Herstellung viraler Komponenten verwendet werden, ohne dass native Viren benötigt werden. [ 71 ]

Phagenvirologie

Viren, die sich in Bakterien, Archaeen und Pilzen vermehren, werden umgangssprachlich als „Phagen“ bezeichnet [ 72 ]. Insbesondere die Bakterien infizierenden Phagen – Bakteriophagen – sind in der Virologie und der Biologie allgemein von großem Nutzen [ 73 ] . Bakteriophagen gehörten zu den ersten Viren, die Anfang des 20. Jahrhunderts entdeckt wurden [ 74 ]. Da sie sich relativ einfach und schnell im Labor züchten lassen, basiert ein Großteil unseres Wissens über Viren auf ihrer Erforschung [ 74 ] . Bakteriophagen, die seit Langem für ihre positiven Auswirkungen auf die Umwelt bekannt sind, werden in Phagen-Display- Verfahren zum Screening von Protein-DNA-Sequenzen eingesetzt . Sie sind ein leistungsstarkes Werkzeug in der Molekularbiologie [ 75 ] .

Genetik

Alle Viren besitzen Gene , die mithilfe der Genetik untersucht werden . [ 76 ] Alle in der Molekularbiologie verwendeten Techniken, wie Klonen, Mutationserzeugung und RNA-Interferenz, werden in der viralen Genetik eingesetzt. [ 77 ]

Neusortierung

Reassortierung bezeichnet den Austausch von Genen verschiedener Eltern und ist besonders nützlich bei der Untersuchung der Genetik von Viren mit segmentierten Genomen (fragmentiert in zwei oder mehr Nukleinsäuremoleküle), wie beispielsweise Influenzaviren und Rotaviren . Auf diese Weise können die Gene identifiziert werden, die Eigenschaften wie den Serotyp kodieren . [ 78 ]

Rekombination

Oft wird Rekombination mit Reassortierung verwechselt. Auch sie bezeichnet die Vermischung von Genen, der Mechanismus unterscheidet sich jedoch dadurch, dass während des Replikationszyklus von DNA oder DNA Abschnitte von DNA- oder RNA-Molekülen – und nicht die vollständigen Moleküle – miteinander verbunden werden. Rekombination ist in der Natur nicht so häufig wie Reassortierung, stellt aber im Labor ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Struktur und Funktion viraler Gene dar. [ 79 ]

Reverse Genetik

Die Reverse Genetik ist eine leistungsstarke Forschungsmethode in der Virologie. [ 80 ] Bei diesem Verfahren werden komplementäre DNA-Kopien (cDNA) von Virusgenomen, sogenannte „infektiöse Klone“, verwendet, um gentechnisch veränderte Viren herzustellen, die dann auf Veränderungen beispielsweise ihrer Virulenz oder Übertragbarkeit getestet werden können. [ 81 ]

Virusklassifizierung

Ein wichtiger Teilbereich der Virologie ist die Virusklassifizierung . Sie ist künstlich, da sie nicht auf evolutionärer Phylogenetik , sondern auf gemeinsamen oder unterscheidenden Eigenschaften von Viren basiert. [ 82 ] [ 83 ] Sie beschreibt die Vielfalt der Viren, indem sie diese anhand von Ähnlichkeiten benennt und gruppiert. [ 84 ] 1962 entwickelten André Lwoff , Robert Horne und Paul Tournier als Erste ein System zur Virusklassifizierung, basierend auf dem hierarchischen System von Linné . [ 85 ] Dieses System ordnet Viren nach Stamm , Klasse , Ordnung , Familie , Gattung und Art . Viren wurden anhand ihrer gemeinsamen Eigenschaften (nicht der ihrer Wirte) und der Art der Nukleinsäure, aus der ihr Genom besteht, gruppiert. [ 86 ] 1966 wurde das Internationale Komitee für die Taxonomie von Viren (ICTV) gegründet. Das von Lwoff, Horne und Tournier vorgeschlagene System wurde vom ICTV zunächst nicht akzeptiert, da die geringe Genomgröße von Viren und ihre hohe Mutationsrate es erschwerten, ihre Abstammung über die Ordnung hinaus zu bestimmen. Daher wurde das Baltimore-Klassifikationssystem als Ergänzung zur traditionelleren Hierarchie verwendet. [ 87 ] Ab 2018 begann das ICTV, tiefer liegende evolutionäre Beziehungen zwischen Viren zu berücksichtigen, die im Laufe der Zeit entdeckt wurden, und führte ein 15-stufiges Klassifikationssystem ein, das von Domänen bis hin zu Arten reicht. [ 88 ] Darüber hinaus werden einige Arten innerhalb derselben Gattung in einer Genogruppe zusammengefasst . [ 89 ] [ 90 ]

ICTV-Klassifizierung

Das ICTV entwickelte das aktuelle Klassifizierungssystem und verfasste Richtlinien, die bestimmten Viruseigenschaften ein höheres Gewicht beimessen, um die Einheitlichkeit der Virusfamilien zu gewährleisten. Eine einheitliche Taxonomie (ein universelles System zur Klassifizierung von Viren) wurde etabliert. Bislang wurde nur ein kleiner Teil der gesamten Vielfalt der Viren erforscht. [ 91 ] Stand 2021 definierte das ICTV 6 Reiche, 10 Domänen, 17 Stämme, 2 Unterstämme, 39 Klassen, 65 Ordnungen, 8 Unterordnungen, 233 Familien, 168 Unterfamilien , 2.606 Gattungen, 84 Untergattungen und 10.434 Virusarten. [ 92 ]

Die allgemeine taxonomische Struktur der Taxonbereiche und die in taxonomischen Namen verwendeten Suffixe werden im Folgenden dargestellt. Stand 2021 werden die Ränge Unterreich, Unterreich und Unterklasse nicht mehr verwendet, alle anderen Ränge hingegen schon. [ 92 ]

Realm ( -viria )
Subrealm ( -vira )
Königreich ( -virae )
Unterreich ( -viriten )
Stamm ( -viricota )
Unterstamm ( -viricotina )
Klasse ( -viricetes )
Unterklasse ( -viricetidae )
Order ( -virales )
Unterordnung ( -virineae )
Familie ( -viridae )
Unterfamilie ( -virinae )
Gattung ( -virus )
Untergattung ( -virus )
Spezies

Baltimore-Klassifikation

Ein Diagramm, das veranschaulicht, wie die Baltimore-Klassifikation auf der DNA oder RNA eines Virus und der Methode der mRNA-Synthese basiert.
Die Baltimore-Klassifikation der Viren basiert auf der Methode der viralen mRNA- Synthese.

Der mit dem Nobelpreis ausgezeichnete Biologe David Baltimore entwickelte das Baltimore-Klassifikationssystem . [ 93 ]

Die Baltimore-Klassifikation von Viren basiert auf dem Mechanismus der mRNA- Produktion. Viren müssen mRNAs aus ihrem Genom generieren, um Proteine ​​herzustellen und sich zu replizieren. Innerhalb jeder Virusfamilie werden jedoch unterschiedliche Mechanismen dafür verwendet. Virale Genome können einzelsträngig (ss) oder doppelsträngig (ds) sein, aus RNA oder DNA bestehen und können Reverse Transkriptase (RT) verwenden oder nicht. Darüber hinaus können ssRNA-Viren entweder Sense (+) oder Antisense (−) sein. Diese Klassifikation teilt Viren in sieben Gruppen ein:

Referenzen

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